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    葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

    2017-01-09 07:05:19朱敏杰郝海英陳潔趙京梅郝曉娟
    安徽醫(yī)藥 2016年11期
    關(guān)鍵詞:葛根素氧化應(yīng)激腎臟

    朱敏杰,郝海英,陳潔,趙京梅,郝曉娟

    (邯鄲市中心醫(yī)院,a.腎內(nèi)二科,b.腎呼吸內(nèi)科,河北 邯鄲 056001)

    ?

    ◇藥學(xué)研究◇

    葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

    朱敏杰a,郝海英a,陳潔a,趙京梅b,郝曉娟a

    (邯鄲市中心醫(yī)院,a.腎內(nèi)二科,b.腎呼吸內(nèi)科,河北 邯鄲 056001)

    目的 研究葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將120只實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為6組:假手術(shù)組,模型組,葛根素高劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(50 mg·kg-1)、低劑量(25 mg·kg-1)治療組,銀杏葉提取物(100 mg·kg-1)治療組;采用夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流灌注的方法建立腎缺血再灌注大鼠模型;再灌注后立即腹腔注射給藥,每天1次,療程2周。稱量各組大鼠體質(zhì)量、腎臟重量并計(jì)算腎臟指數(shù),測定24 h尿量和24 h尿蛋白量(UPro),測定血清中血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)含量,通過蘇木精-尹紅(HE)染色觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察腎小球細(xì)胞凋亡狀況,并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI);測定腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,通過ELISA法測定血清中白介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量水平。結(jié)果 較模型組,葛根素高、中劑量組大鼠腎臟重量減輕且腎臟指數(shù)降低,24 h尿量和UPro均減少,血清中BUN、SCr、UA含量降低,上述均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);葛根素治療組大鼠腎臟組織病變和腎小球細(xì)胞凋亡狀況呈不同程度改善,以葛根素高劑量組效果最為顯著,并且葛根素高、中劑量組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組降低(P<0.05,P<0.01);葛根素高、中劑量組腎臟組織中SOD、CAT活性升高且MDA含量降低,血清中IL-1和TNF-α含量降低,且高劑量組GSH-Px活性升高,上述均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織具有保護(hù)作用;其機(jī)制可能與葛根素能夠有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

    葛根素;腎臟;缺血再灌注;保護(hù);機(jī)制

    腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是臨床上開展腎臟手術(shù)以及失血、休克時(shí)常發(fā)生的腎組織損傷現(xiàn)象,其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年來病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)隨著腎臟血流恢復(fù)供應(yīng),氧大量涌入而導(dǎo)致氧自由基的大量生成與過剩,誘發(fā)腎臟組織氧化應(yīng)激損傷以及繼發(fā)的細(xì)胞凋亡是造成RIRI的重要因素[1-2]。黃仁發(fā)等[3]研究均發(fā)現(xiàn),炎性反應(yīng)在RIRI的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用。葛根素(puerarin)是我國傳統(tǒng)中藥葛根的主要有效成分,現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn),葛根素屬于異黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、調(diào)脂、抗凋亡等多種生物學(xué)活性[4-7]。銀杏葉提取物具有活血、化淤、通絡(luò)的功效,廣泛應(yīng)用于腦部及周圍血流循環(huán)障礙[8],并且銀杏葉提取物能夠改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制腎小球細(xì)胞凋亡而對(duì)RIRI起到確切的保護(hù)作用[9]。本研究采用夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流再灌注的方法建立的腎缺血再灌注大鼠模型,并以銀杏葉提取物為陽性對(duì)照,研究葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。

    1 材料

    1.1 藥物與試劑 葛根素注射液(江西銀濤藥業(yè)有限公司,規(guī)格:2 mL:100 mg,批號(hào) 20140518);金納多注射液(德國威瑪舒培大藥廠,每支5 mL,含有銀杏提取物17.5 mg,批號(hào)1514904);血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)、24 h尿蛋白量(UPro)試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒,TUNEL染色試劑盒購自北京博奧森公司;烏拉坦購自北京化學(xué)試劑公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠(清潔級(jí),雄性,7周齡,體質(zhì)量180~220 g),購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(冀)2013-1-003,動(dòng)物批號(hào):20140912。

    1.3 主要儀器 UV759紫外-可見分光光度計(jì)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司);BS-200型生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);iMark型酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad公司)。

    2 方法

    2.1 動(dòng)物分組與模型的制備 將120只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組,模型組,葛根素高劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(50 mg·kg-1)、低劑量(25 mg·kg-1)治療組,銀杏葉提取物(100 mg·kg-1)治療組,各20只;除假手術(shù)組外,其余各組大鼠均參照Chatterjee等[10]報(bào)道的方法制備腎缺血再灌注大鼠模型:實(shí)施麻醉后于脊柱雙側(cè)行腎區(qū)切口、暴露雙側(cè)腎臟,剝離雙側(cè)腎蒂血管并用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉45 min后松夾恢復(fù)血流灌注,逐層縫合;假手術(shù)組大鼠行手術(shù)通路但不夾閉腎蒂血管。通過HE染色觀察組織病理切片發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整、腎小管結(jié)構(gòu)完整;而模型組大鼠腎臟組織呈現(xiàn)腎小管結(jié)構(gòu)破壞、腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、管腔內(nèi)可見脫落的細(xì)胞和管型尿,間質(zhì)區(qū)可見淋巴細(xì)胞浸潤等明顯的病理性形態(tài)學(xué)變化,結(jié)果見圖1,說明造模成功。各治療組分別于再灌注后立即通過腹腔注射給藥,假手術(shù)組和模型組均同步給予等體積生理鹽水,每天1次,療程2周。

    圖1 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化(HE×400)

    2.2 體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量的稱量及腎臟指數(shù)的計(jì)算 治療完成后稱量各組大鼠體質(zhì)量;麻醉后取腎臟組織并稱量左側(cè)腎質(zhì)量,然后計(jì)算腎臟指數(shù):

    腎臟指數(shù)(mg·g-1)=左側(cè)腎臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

    2.3 24 h尿量及UPro的測定 治療完成后,插導(dǎo)尿管并測量各組大鼠24 h尿量,并按照試劑盒操作方法步驟分析測定各組大鼠UPro水平。

    2.4 血清中BUN、SCr、UA含量的測定 治療完成后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,離心(2 000 r·min-1,5 min)后取血清,按照各測定試劑盒操作方法進(jìn)行處理后,通過全自動(dòng)生化分析儀測定各組大鼠血清中BUN、SCr、UA含量。

    2.5 腎臟組織形態(tài)結(jié)果改變的觀察 取“2.2”步驟稱量后的左側(cè)腎臟組織,置于4%的多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定,經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)和展片處理后,行常規(guī)HE染色和復(fù)染,通過光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

    2.6 腎小球細(xì)胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(shù)(Apoptosis Index,AI)的計(jì)算 取“2.5”所制備的石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化處理后,按照TUNEL染色試劑盒操作方法步驟依次進(jìn)行處理,然后通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡狀況。AI的計(jì)算:每只大鼠取5張切片,每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)以及陽性細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞核黃染),取平均值,然后計(jì)算AI:

    AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%

    2.7 腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的測定 取右側(cè)腎臟組織,剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿,離心(3 000 r·min-1,10 min)后取上清液,然后按照試劑盒操作方法步驟,采用比色法、通過紫外-可見分光度計(jì)測定各組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

    2.8 血清中IL-1和TNF-α含量的測定 取“2.4”所制備的血清,按照ELISA試劑盒操作方法步驟進(jìn)行處理,最后通過酶標(biāo)儀測定各組大鼠血清中IL-1和TNF-α含量。

    3 結(jié)果

    3.1 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響 結(jié)果如表1所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)均升高(P<0.01);經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后,腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟質(zhì)量減輕且腎臟指數(shù)降低(P<0.05,P<0.01)。

    3.2 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠24 h尿量和UPro的影響 結(jié)果如表2所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠24 h尿量和UPro均升高(P<0.01);經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后,腎缺血再灌注損傷大鼠24 h尿量和UPro均降低(P<0.05,P<0.01)。

    表1 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01。

    表2 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠24 h尿量和UPro的影響

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.01;與模型組比較:bP<0.05,cP<0.01。

    3.3 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中BUN、SCr、UA含量的影響 結(jié)果如表3所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中BUN、SCr、UA含量升高(P<0.01);經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后,腎缺血再灌注損傷大鼠血清中BUN、SCr、UA含量降低(P<0.05,P<0.01)。

    表3 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中BUN、SCr、UA含量的影響

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.01;與模型組比較:bP<0.05,cP<0.01。

    3.4 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎小球細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果如圖2所示,假手術(shù)組大鼠腎臟組織僅存在極少量的凋亡細(xì)胞;而模型組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡數(shù)量增多,經(jīng)葛根素治療2周后,腎缺血再灌注損傷大鼠腎小球細(xì)胞凋亡數(shù)量減少,以葛根素高劑量組效果最為顯著;計(jì)算AI結(jié)果如表4所示:與假手術(shù)組比較,模型組大鼠細(xì)胞AI升高(P<0.01),經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后,腎缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞AI降低(P<0.05,P<0.01)。

    圖2 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎小球細(xì)胞凋亡的影響(HE×400)

    表4 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎小球細(xì)胞AI的影響

    注:與假手術(shù)組比較:aP<0.01;與模型組比較:bP<0.05,cP<0.01。

    3.5 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響 結(jié)果如表5所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性低且MDA含量升高(P<0.01);經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后,腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中SOD、CAT活性升高且MDA含量降低(P<0.05,P<0.01),高劑量治療組GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。

    3.6 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量的影響 結(jié)果如表6所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中IL-1和TNF-α含量均升高(P<0.01);經(jīng)葛根素高、中劑量治療2周后,腎臟缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量降低(P<0.05,P<0.01)。

    表5 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響

    注:與假手術(shù)組比較:aP<0.01;與模型組比較:bP<0.05,cP<0.01。

    表6 葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量的影響

    注:與假手術(shù)組比較,aP<0.01;與模型組比較:bP<0.05,cP<0.01。

    4 討論

    腎臟組織血流量非常豐富,對(duì)缺血再灌注損傷非常敏感,常見于腎臟手術(shù)、嚴(yán)重出血、休克等之后。RIRI是導(dǎo)致腎功能衰竭的危險(xiǎn)因素之一,其死亡率高達(dá)50%以上[11]。目前對(duì)RIRI的發(fā)病機(jī)制尚未明確,有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及繼發(fā)的細(xì)胞凋亡在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用。游離并夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流灌注是制備RIRI大鼠模型的常用方法[10],該方法制備的模型大鼠呈現(xiàn)腎臟組織氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及腎小管率過濾升高且重吸收率降低所致尿量、24 h UPro、BUN、SCr、UA增多等病理性改變。

    體內(nèi)活性氧自由基(ROS)過剩是導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的病理基礎(chǔ),正常生理狀態(tài)下,ROS的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡,其中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)對(duì)ROS的清除發(fā)揮著重要的催化作用[12-14];當(dāng)ROS生成增多或抗氧化酶活性降低時(shí),將導(dǎo)致體內(nèi)ROS的過剩而攻擊細(xì)胞膜而造成臟器的脂質(zhì)過氧化損傷,因此脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映氧化應(yīng)激損傷程度。炎癥因子IL-1和TNF-α在RIRI的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用[15],IL-1能夠引發(fā)中性粒細(xì)胞向腎組織浸潤,從而加劇腎組織損傷;TNF-α不但具有直接細(xì)胞毒作用,而且還能夠促進(jìn)IL-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,從而加劇炎性細(xì)胞的浸潤和聚集。

    細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡,該過程中存在著非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,其中Bcl-2基因家族和Caspase蛋白家族在細(xì)胞凋亡過程中起著非常重要的調(diào)控作用[16]。細(xì)胞凋亡具有多種誘發(fā)因素,包括氧化應(yīng)激損傷,而NF-κB蛋白則被稱為連接氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的“橋梁”;常態(tài)下,NF-κB以無活性形式存在于胞質(zhì)中,而當(dāng)受到外界因素刺激時(shí)NF-κB將進(jìn)入胞核并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

    本研究通過夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復(fù)血流灌注的方法建立腎缺血再灌注大鼠模型,通過HE染色觀察病理切片、TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡、檢測炎癥細(xì)胞因子以及尿量、UPro、BUN、SCr、UA指標(biāo)發(fā)現(xiàn)其病理性改變與Chatterjee等[10]的研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過葛根素治療能夠有效降低RIRI大鼠腎臟指數(shù),減少尿量和尿蛋白量,降低BUN、SCr、UA含量,改善腎功能、降低腎小管率過濾、提高腎小管重吸收率,改善腎臟組織病變、抑制腎小球細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),葛根素治療能夠有效改善RIRI大鼠腎臟組織抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性、降低MDA含量、降低炎癥細(xì)胞因子(IL-1、TNF-α)水平;提示葛根素對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎臟組織具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與葛根素能夠改善腎小球?yàn)V過率和腎小管重吸收率、降低尿量,抑制氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)有關(guān)。

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    Protection and mechanism of puerarin on the kidneys in ischemic-reperfusion rats

    ZHU Minjie,HAO Haiying,CHEN Jie,et al

    (SecondDepartmentofNephrology,HandanCentralHospital,Handan,Hebei056001,China)

    Objective To investigate the protection and mechanism of puerarin on the kidneys in ischemic-reperfusion rats.Methods One hundred and twenty experimental rats were randomized into six groups:sham operation group,renal ischemic-reperfusion model control group,puerarin 25,50,100 mg·kg-1treatment groups and ginkgo biloba extract(EGb)100 mg·kg-1treatment group.The model rats were made by gripping bilateral renal pedicle vascular for 45min,then the drugs were given immediately after reperfusion,once a day for 2 weeks.Two weeks later,the body mass and renal weight were determined and the renal index(RI)was calculated;the urine volume and the UPro were determined;the content of BUN,SCr,UA in serum were determined;the histopathological changes of renal tissue were observed by HE staining;the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining,and the apoptosis index(AI)was calculated;the activities of SOD,GSH-Px and CAT and the content of MDA in renal tissue were determined;the contents of IL-1 and TNF-α in serum were determined by ELISA.Results Compared with renal ischemic-reperfusion model control group,the renal weight and RI in puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01);the urine volume and the UPro in puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),and the content of BUN,SCr,UA in serum were significantly decreased(P<0.05,P<0.01).The histopathological changes and the apoptosis of the renal tissue in puerarin treatment groups were significantly improved,especially in the puerarin 100 mg·kg-1treatment group,and theAIof puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01).The activities of SOD,CAT in renal tissue of puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly increased and the contents of MDA were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),the contents of IL-1 and TNF-α in serum were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),and the activity of GSH-Px of puerarin 100 mg·kg-1treatment group was significantly increased(P<0.05,P<0.01).Conclusions Puerarin had protective effects on kidneys in ischemic-reperfusion rats,which was perhaps related to its effects on improving the activity of antioxidant enzymes,reducing oxidative stress injury and inhibiting inflammatory response.

    Puerarin;Kidneys;Ischemic-reperfusion;Protection;Mechanism

    10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.006

    2016-04-23,

    2016-08-07)

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