液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測飼料中硫酸黏桿菌素

■李延山

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧沈陽110016）

硫酸黏桿菌素是由多黏芽孢桿菌產(chǎn)生的一組功能相似的多肽類抗生素，主要以硫酸黏桿菌素E1和硫酸黏桿菌素E2為主。硫酸黏桿菌素對革蘭氏陰性菌有顯著的抑菌作用并且有一定的促生長作用，因此硫酸黏桿菌素在畜牧業(yè)中被廣泛應(yīng)用。農(nóng)業(yè)部168號公告明確規(guī)定飼料中硫酸黏桿菌素使用范圍、添加用量以及休藥期。然而隨著飼料中抗生素添加帶來的細(xì)菌耐藥性問題、畜產(chǎn)品中抗生素殘留等問題逐漸凸顯。農(nóng)業(yè)部2428號公告做出修訂，自2017年4月30日起，硫酸黏桿菌素不得添加于飼料中用于促生長作用。因此，可靠的飼料中硫酸黏桿菌素檢測方法是管控硫酸黏桿菌素濫用的重要保障。

1 研究內(nèi)容

1.1 確定檢測參數(shù)

硫酸黏桿菌素是由多黏芽孢桿菌產(chǎn)生的一組功能相似的多肽類抗生素，主要以硫酸黏桿菌素E1和硫酸黏桿菌素E2為主。因此，用硫酸黏桿菌素E1與硫酸黏桿菌素E2總含量來表示硫酸黏桿菌素的含量。

1.2 確定對照品稀釋液

用乙腈∶甲酸∶水體積比為20∶0.2∶79.8的混合溶液，將硫酸黏桿菌素儲備液稀釋為C=50 ng/ml，并上機(jī)測定，結(jié)果表明硫酸黏桿菌素峰面積穩(wěn)定不減小。因此將乙腈∶甲酸∶水體積比為20∶0.2∶79.8的混合溶液確定為對照品稀釋液。

1.3 考查線性相關(guān)性

用20%乙腈甲酸水溶液配置硫酸黏桿菌素E1與E2工作液，硫酸黏桿菌素E1與E2系列濃度分別為25、50、100、200、500、1 000 ng/ml，相同條件下，用串聯(lián)質(zhì)譜檢測上述曲線各點(diǎn)的峰面積，硫酸黏桿菌素E1的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.999 8，硫酸黏桿菌素E2的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

1.4 凈化小柱、洗脫液與凈化程序

1.4.1 凈化小柱的選擇

分別選擇HLB、C18、MCX、MAX、PCX五款凈化小柱，過柱條件參照現(xiàn)行國標(biāo)：3 ml甲醇活化，3 ml 0.1%甲酸緩沖液平衡后，取3 ml標(biāo)準(zhǔn)工作液（C=200 ng/ml），3 ml 0.1%甲酸緩沖液淋洗，抽干。3 ml 20%乙腈甲酸水溶液洗脫，20%乙腈甲酸水溶液定容至5 ml。0.22 μm微孔濾膜過濾?？疾靸艋≈厥章拾l(fā)現(xiàn)：HLB優(yōu)于C18、MCX、MAX、PCX。因此凈化小柱選擇HLB。

1.4.2 洗脫液的選擇

分別考察乙腈∶甲酸∶水體積比為10∶0.2∶89.8；乙腈∶甲酸∶水體積比為15∶0.2∶84.8；乙腈∶甲酸∶水體積比為20∶0.2∶79.8；乙腈∶甲酸∶水體積比為40∶0.2∶59.8；乙腈∶甲酸∶水體積比為70∶0.2∶29.8；乙腈：甲酸體積比為99.8∶0.2。結(jié)果顯示：乙腈含量＜20%的洗脫液不能完全洗脫，乙腈含量≥20%的洗脫液雖可完全洗脫；但乙腈含量越高，質(zhì)譜圖中雜峰越多，因此洗脫液確定為乙腈∶甲酸∶水體積比為20∶0.2∶79.8的洗脫液。

1.4.3 凈化程序

3 ml甲醇、3 ml 0.1%甲酸水溶液依次平衡HLB小柱，取一定體積的樣液上柱，3 ml 0.1%甲酸水溶液淋洗，抽干，3 ml 20%乙腈甲酸水溶液洗脫，并用20%乙腈甲酸水溶液定容至5 ml，過0.22 μm濾膜后上機(jī)測定。

1.5 提取液與提取方法

1.5.1 提取液

分別考察2%三氯乙酸+10 ml 4%乙酸鉛；4%三氯乙酸+10 ml 4%乙酸鉛；19 ml 0.5%甲酸水+1 ml飽和乙酸鉛；19 ml 0.5%乙酸+1 ml飽和乙酸鉛；19 ml 5%草酸+1 ml飽和乙酸鉛；19 ml 10%草酸+1 ml飽和乙酸鉛；20 ml 5%草酸；20 ml 10%草酸；20 ml 5%檸檬酸；19 ml 10%檸檬酸+1ml飽和乙酸鉛?；厥赵囼?yàn)結(jié)果顯示：20 ml 5%草酸為提取液適用性較好。

1.5.2 提取方法

稱取2 g（精確到0.000 1 g）試樣于50 ml離心管中，準(zhǔn)確加入20 ml 5%草酸提取液，渦旋混勻，超聲提取15 min，然后于8 000 r/min離心5 min，上清液備用。

1.6 儀器條件的確定

1.6.1 色譜條件的選擇

本試驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室常用C18色譜柱，以乙腈、甲醇、水作為流動相進(jìn)行研究。由于硫酸黏桿菌素中含有氮原子和氧原子，易于接受氫質(zhì)子，因此質(zhì)譜檢測方式選用正離子模式。經(jīng)試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，選用C18色譜柱（柱長100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑2.4 μm）、0.2%甲酸水溶液和乙腈作為流動相，得到的色譜峰對稱性好，無拖尾現(xiàn)象，待測物與樣品中的雜質(zhì)分離效果理想。

液相色譜條件為：色譜柱為C18柱，柱長100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑2.4 μm；流動相：A相為乙腈；B相為0.2%甲酸水溶液,梯度洗脫（見表1）；柱溫40℃；進(jìn)樣量20 μl。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.6.2 質(zhì)譜條件的選擇

由于儀器廠家不同，質(zhì)譜各參數(shù)也不一致。本試驗(yàn)采用Waters6890液質(zhì)聯(lián)用儀，其參考條件如下：離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓、碰撞能量等參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度；定性離子對、定量離子對等參數(shù)見表2。

表2 硫酸黏桿菌素的定性、定量離子對及碰撞能量參考值

1.7 樣品基質(zhì)效應(yīng)對回收率的影響

用20%乙腈甲酸水溶液洗脫并定容樣液，樣品基質(zhì)效應(yīng)明顯降低，可忽略不計。

1.8 空白飼料樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)(見表3)

空白飼料樣品涵蓋飼料原料、配合飼料、濃縮飼料與預(yù)混料。其中玉米面、豆粕、配合飼料、濃縮飼料、維生素預(yù)混料、復(fù)合預(yù)混料的回收結(jié)果在70%～110%；但礦物質(zhì)預(yù)混料回收率為35%左右?；厥赵囼?yàn)表明，該方法定量檢測方面除了礦物質(zhì)預(yù)混料，其他飼料均有較好的適用性。定性方面，適用于所有飼料。

1.9 檢出限與定量限。

空白飼料中硫酸黏桿菌素E1、E2添加濃度為50 μg/kg，信噪比＞10，因此定量限確定為50 μg/kg?？瞻罪暳现辛蛩狃U菌素E1、E2添加濃度為15 μg/kg，信噪比＞3，因此檢出限確定為15 μg/kg。

2 討論

①以礦物質(zhì)預(yù)混料為空白基質(zhì)，做添加回收，回收率在35%左右，可能是礦物質(zhì)預(yù)混料中含有某些離子，這些離子干擾了HLB的平衡，影響了洗脫液的洗脫效果。

②用20%乙腈甲酸水溶液作為對照品稀釋液，起到明顯的抑制基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果，樣品基質(zhì)的影響可以忽略。這可能是在串聯(lián)質(zhì)譜檢測時，乙腈能有效促進(jìn)硫酸黏桿菌素的電離，抑制樣品基質(zhì)中的離子效應(yīng)。

表3 硫酸黏桿菌素的添加回收試驗(yàn)統(tǒng)計

③用20%乙腈甲酸水溶液作為對照品稀釋液，發(fā)現(xiàn)硫酸黏桿菌素工作液在24 h內(nèi)峰值很穩(wěn)定，說明20%的乙腈可以有效地阻止硫酸黏桿菌素的降解，提高了硫酸黏桿菌素在溶液中的穩(wěn)定性。

3 結(jié)果(見圖1)

圖1 硫酸黏桿菌素對照品C=200 ng/ml的質(zhì)譜圖

①硫酸黏桿菌素E1的相關(guān)系數(shù)為0.999 8，硫酸黏桿菌素E2的相關(guān)系數(shù)為0.999 9；

② 方法的定量限50 μg/kg，檢出限為15 μg/kg；

③相對偏差小于20%；

④ 除礦物質(zhì)預(yù)混料以外，回收率達(dá)到70%～110%。該方法定量檢測除了礦物質(zhì)預(yù)混料外均適用；該方法定性檢測適合所有種類的飼料。