補(bǔ)骨脂果皮和種子中化學(xué)成分的分布規(guī)律研究*

李 敏，楊君君，楊 靜，王躍飛，柴 欣

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的果實(shí)，是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用廣泛。補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉的功效，內(nèi)用治療腰膝冷痛、滑精、遺尿、虛寒咳嗽，外用治療白癜風(fēng)[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)骨脂具有增加心肌收縮力、增強(qiáng)免疫[2]、擴(kuò)張血管、抗菌[3-4]、抗炎[5-6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8-9]、雌激素樣等作用[10-11]。生補(bǔ)骨脂由果皮和種子構(gòu)成，果皮中含有壁內(nèi)腺、維管束等；種子由種皮、子葉、胚等組成，具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[12]。文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂中含有100多種化合物，主要包括香豆素、黃酮、單萜酚類化合物[13-15]。

中藥安全性問(wèn)題日益引起人們的關(guān)注，關(guān)系中醫(yī)藥的健康持續(xù)發(fā)展[16]。隨著補(bǔ)骨脂的臨床應(yīng)用不斷擴(kuò)大，其肝臟毒性問(wèn)題也倍受關(guān)注。周昆等研究表明補(bǔ)骨脂水提取液具有肝毒性，且水提液中主要成分為補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素[17]；Cheung等報(bào)道了補(bǔ)骨脂中相關(guān)化學(xué)成分可導(dǎo)致肝臟毒性[18]。補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，導(dǎo)致補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的大量吸收，可能是導(dǎo)致肝臟毒性的原因[19]。

圖1 補(bǔ)骨脂橫切面簡(jiǎn)圖Fig.1 Cross-section diagram of Fructus Psoralea

本研究采用超高效液相色譜法系統(tǒng)研究補(bǔ)骨脂香豆素、黃酮、單萜酚等化學(xué)成分在果皮和種子中的分布情況，以期闡明其化合物的分布規(guī)律，為補(bǔ)骨脂的成分研究、加工炮制工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀：Waters ACQUITYTMUPLCsystem（美國(guó)沃特世公司），XS205型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），SCIENTZSB 25-12DTN型超聲波清洗器（寧波新芝生物有限公司，功率：300 W，頻率：40 kHz），TGL-16C 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品及試劑 補(bǔ)骨脂素（批號(hào)110738-201313）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào) 110739-201115）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂香豆雌烷 B、補(bǔ)骨脂定、4″，5″-去氫異補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、巴庫(kù)查爾酮、補(bǔ)骨脂寧、Corylifol A、Corylifol C、補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂酚均為實(shí)驗(yàn)室自制[NMR、MS鑒定化合物結(jié)構(gòu)，超高效液相色譜-紫外法（UPLC-UV）分析純度≥98%]。甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。

生補(bǔ)骨脂：由天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實(shí)，產(chǎn)地分別為廣西（GX）、河北 1（HB 1）、河北2（HB 2）、河南（HN）。

生補(bǔ)骨脂果皮、種子：取生補(bǔ)骨脂藥材，用刀片將果皮和種子剝離，備用。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）溶液，梯度洗脫（0～20 min，10%→74%A；20～25min，74%→90%A）；柱溫 60℃；流速 0.3mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；進(jìn)樣量：2μL。

表1 生補(bǔ)骨脂果皮和種子的質(zhì)量Tab.1 Mass of pericarp and seed of Fructus Psoralea

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別取補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂香豆雌烷B、Corylifol C、巴庫(kù)查爾酮、補(bǔ)骨脂甲素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定、4″，5″-去氫異補(bǔ)骨脂定、Corylifol A、補(bǔ)骨脂查爾酮、補(bǔ)骨脂酚標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，制成質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

分別取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，混勻，得對(duì)照品工作液，其濃度為補(bǔ)骨脂苷40.80μg/mL、異補(bǔ)骨脂苷41.20μg/mL、補(bǔ)骨脂素106.00μg/mL、異補(bǔ)骨脂素104.00μg/mL、補(bǔ)骨脂香豆雌烷B 40.83μg/mL、Corylifol C46.67μg/mL、巴庫(kù)查爾酮 42.92μg/mL、補(bǔ)骨脂甲素42.08μg/mL、新補(bǔ)骨脂異黃酮41.25μg/mL、補(bǔ)骨脂寧50.42μg/mL、補(bǔ)骨脂乙素47.08μg/mL、補(bǔ)骨脂定 45.00 μg/mL、4″，5″-去氫異補(bǔ)骨脂定43.33μg/mL、Corylifol A 44.17μg/mL、補(bǔ)骨脂查爾酮42.08μg/mL、補(bǔ)骨脂酚41.67μg/mL。

2.3 供試品溶液制備 取果皮，粉碎，取粉末0.3 g，精密稱定，置于100 mL的容量瓶中，加適量甲醇，密塞，60℃超聲處理（功率300 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加1 mL 30%甲醇水溶液，搖勻，即得果皮供試品溶液，備用。

取種子，粉碎，取粉末0.25 g，精密稱定，置于100 mL的容量瓶中，加適量甲醇，密塞，60℃超聲處理（功率 300 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加1 mL 30%甲醇水溶液，搖勻，即得種子供試品溶液，備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 補(bǔ)骨脂果皮和種子質(zhì)量分布情況 取4批生補(bǔ)骨脂藥材，按“1.2”項(xiàng)下方法處理生補(bǔ)骨脂，分離生補(bǔ)骨脂果皮和種子，分別稱取質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，產(chǎn)地分別為廣西、河北、河南的生補(bǔ)骨脂，種子占生補(bǔ)骨脂總質(zhì)量的54.29%～66.67%；果皮占生補(bǔ)骨脂總質(zhì)量的33.33%～45.71%。

3.2 補(bǔ)骨脂果皮和種子中化合物分布規(guī)律研究 取生補(bǔ)骨脂果皮、種子，按“2.3”項(xiàng)下供試品制備方法制備果皮、種子供試品溶液，每種樣品稱取2份，按“2.1”項(xiàng)下方法分析供試品溶及對(duì)照品溶液中主要成分，每份樣品平行進(jìn)樣2次，色譜圖見(jiàn)圖2。

為了獲得生補(bǔ)骨脂中化合物分布情況，分別讀取果皮和種子供試品溶液中各化合物的峰面積，按照下式計(jì)算生補(bǔ)骨脂果皮和種子中化合物的相對(duì)含量，分別標(biāo)記為Pi%和Pi′%，計(jì)算公式如下：

其中，i代表化合物，Pi%為化合物i在果皮中的量占該化合物總量的百分比；M為生補(bǔ)骨脂的果皮質(zhì)量；M′為生補(bǔ)骨脂的種子質(zhì)量；A為果皮供試品溶液中化合物i的峰面積；A′為種子供試品溶液中化合物i的峰面積；m為制備果皮供試品溶液時(shí)的果皮粉末取樣量；m′為制備種子供試品溶液時(shí)的種子粉末取樣量。Pi′%為化合物i在種子中的量占該化合物總量的百分比。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，生補(bǔ)骨脂種子中主要含有補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷，分別占生補(bǔ)骨脂果實(shí)中補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷總量的89.63%以上；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定、4″，5″-去氫異補(bǔ)骨脂定分別占其總量的16.67%～63.39%；含有少量黃酮和單萜酚類化合物。果皮中主要含有黃酮和單萜酚類化合物，果皮中Corylifol C、巴庫(kù)查爾酮、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂酚等黃酮和單萜酚類化合物分別占其總量的80.86%以上；補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷分別占其總量的10.37%以下，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素占其總量的36.61%～76.87%，補(bǔ)骨脂香豆雌烷B占其總量的63.33%，補(bǔ)骨脂定和4″，5″-去氫異補(bǔ)骨脂定占其總量的42.55%～83.33%。

圖2 對(duì)照品溶液（A）、補(bǔ)骨脂果皮（B）、種子（C）供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms of the standard solution(A)and sample solution of pericarp(B)and seed(C)of Fructus Psoralea

表2 生補(bǔ)骨脂果皮和種子中化合物的分布情況Tab.2 Distribution of compounds in pericarp and seed of Fructus Psoralea %

生補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷主要存在于生補(bǔ)骨脂的種子中，而黃酮、單萜酚、脂溶性香豆素主要存在于生補(bǔ)骨脂的果皮中，因此可以通過(guò)分離補(bǔ)骨脂果皮和種子快速富集補(bǔ)骨脂中化學(xué)成分。此外，除去種子可去除大量補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷，大幅減少提取物中補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的含量，從而減少補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化為補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素[19]，降低肝臟毒性風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜法測(cè)定生補(bǔ)骨脂果皮、種子中化合物相對(duì)含量，闡釋香豆素、黃酮、單萜酚在果皮和種子中分布規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷主要存在于種子中，黃酮和單萜酚類化合物主要存在于果皮中，脂溶性香豆素類成分在果皮和種子中均有分布。