痰熱清注射液對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道黏液高分泌的影響*

蔡凌峰,王慧賢,林觀康,黃東暉△

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) (廣州 510000)；2廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(珠海 519000)；3.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(廣州 510000)

·論 著·

痰熱清注射液對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道黏液高分泌的影響*

蔡凌峰1,王慧賢2,林觀康3,黃東暉2△

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) (廣州 510000)；2廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(珠海 519000)；3.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(廣州 510000)

目的 觀察痰熱清注射液對(duì)慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)模型大鼠氣道黏液高分泌的影響，探討“清熱化痰”的效應(yīng)機(jī)制。方法 采用簡單隨機(jī)法將SD大鼠60只分為正常組、模型組和痰熱清組，每組20只。采用香煙煙熏加氣道內(nèi)滴注脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，于實(shí)驗(yàn)第41日開始，痰熱清組予痰熱清注射液、模型組及正常組予生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測大鼠肺組織中黏蛋白5AC(MUC5AC)mRNA水平，并觀察肺組織病理形態(tài)的變化。結(jié)果 RT-PCR檢測顯示，痰熱清組MUC5AC mRNA的表達(dá)程度較模型組低(P<0.05)。病理學(xué)檢測(HE染色)示模型大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡壁破裂、肺泡腔擴(kuò)大、肺泡融合，并伴有炎細(xì)胞浸潤。過碘酸雪夫染色(AB-PAS)下可見痰熱清組大鼠支氣管黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞較模型組明顯減少，痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積明顯小于模型組(P<0.05)。結(jié)論 痰熱清注射液能抑制COPD模型大鼠MUC5AC mRNA的表達(dá)，并可能藉此減輕氣道黏液高分泌，改善氣道阻塞。

痰熱清注射液；慢性阻塞性肺疾??；氣道黏液高分泌；MUC5AC mRNA

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)居全球死亡原因第4位，世界衛(wèi)生組織研究顯示,COPD的全球經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)至2020年將攀至所有疾病的第5位[1]。氣道黏液高分泌是COPD的主要特征之一,也是COPD急性發(fā)作和預(yù)后變差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；既易致呼吸道細(xì)菌定植，又會(huì)使肺通氣功能下降。然而，目前氣道黏液高分泌的治療療效不佳，患者從中獲益極小，故其已成為COPD防治研究的新熱點(diǎn)?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，COPD急性加重時(shí)證候多為痰熱壅肺證[2-3]，而清熱化痰法則是逆轉(zhuǎn)COPD急性加重的重要治法；研究證明祛痰中藥可減少黏液分泌量，降低痰黏稠度，從而縮短氣道黏液高分泌亢進(jìn)狀態(tài)的時(shí)間[4-5]，同時(shí)大量研究已證實(shí)痰熱清注射液具有抗炎、祛痰止咳的效果，對(duì)慢性支氣管炎和慢性阻塞性肺病急性加重具有顯著作用[6-7]。本研究采用氣道內(nèi)滴注脂多糖聯(lián)合煙熏的復(fù)合方法建立COPD大鼠模型，通過觀察肺組織杯狀細(xì)胞增生程度及RT-PCR法檢測MUC5AC蛋白轉(zhuǎn)錄子表達(dá)，探討痰熱清注射液的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥物 痰熱清注射液(10 mL/支)，上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)Z20030054；脂多糖(LPS)，貨號(hào)L2880-10MG。大前門香煙，焦油量23 mg/支，上海卷煙廠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠，雄性，共60只，鼠齡10～12周，體質(zhì)量(200±20) g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)4400210000 4220。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后開始實(shí)驗(yàn)，于實(shí)驗(yàn)流程第1天采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為3組：正常組、模型組和痰熱清組，每組20只，記錄大鼠體質(zhì)量。

1.1.3 主要儀器與試劑 Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR儀(Thermo Scientific公司)；7500 Real Time PCR System熒光定量基因擴(kuò)增儀(Thermo Scientific公司)；Allegra X-22R多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter 公司)； Eppendorf 系列微量移液器(德國 Eppendorf 公司)；光學(xué)顯微鏡、顯微攝像儀(日本OLYMPUS 公司)；自制動(dòng)物熏吸箱(60 cm×50 cm×40 cm)。SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，型號(hào)RR820A，批號(hào)AK6703)；PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time，型號(hào)RR036A，批號(hào)A3601-1)；上述試劑盒均由Takara公司生產(chǎn)；Trizol(型號(hào)15596026)由invitrogen公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模及給藥方法 在第1、8和15天，用1%的戊巴比妥鈉(40 mg /kg) 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號(hào)靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 mL 注射器注入溶于生理鹽水的LPS 200 μL(1 g/L) ，然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使LPS 能夠均勻分布于兩肺。正常組同期氣管內(nèi)注入生理鹽水，其余無特殊處理。第2～40天(第8、15天除外)將大鼠置入熏吸箱內(nèi)，內(nèi)熏10支香煙，每天上午、下午各30 min。實(shí)驗(yàn)第41～50天停止煙熏，痰熱清組予痰熱清注射液腹腔注射(痰熱清注射液以1∶5的比例用生理鹽水稀釋，劑量按成人最大40 mL/60 kg計(jì)算)，每日一次；正常組及模型組則予腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水，每日一次。以上給藥共10 d。

1.2.2 取材及標(biāo)本制備方法 從實(shí)驗(yàn)第51天起進(jìn)行取材及指標(biāo)檢測。1 %(40 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，開胸取左肺迅速置入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于RT-PCR檢測；每組隨機(jī)選取7只大鼠，取右肺用4 %多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，行HE染色及AB-PAS染色；每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，各取照片1張(HE：100 ×，AB-PAS：400 ×)。

1.2.3 RT-PCR檢測方法 左肺制作組織勻漿后，從組織勻漿中以Trizol法提取RNA，再按試劑盒說明書步驟以RT-PCR法檢測組織中MUC5AC mRNA表達(dá)程度 (引物序列見表1)。

表1 引物序列

1.3 圖片處理

運(yùn)用Image-pro Plus(v6.0)對(duì)攝取的AB-PAS染色切片圖像進(jìn)行計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共60只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)過程中死亡5只，其中痰熱清組3只，模型組2只，分別于實(shí)驗(yàn)第8日、第15日氣道內(nèi)滴入LPS后或其后2 d內(nèi)的煙熏中死亡。可能的死亡原因?yàn)樵炷：蟠笫蟮幕A(chǔ)狀況及肺功能明顯變差，對(duì)麻醉藥物以及煙熏的耐受程度下降。

2.2 HE染色觀察

對(duì)3組大鼠肺組織病理切片進(jìn)行觀察，正常組可見肺內(nèi)各級(jí)支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，支氣管周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；肺泡結(jié)構(gòu)連續(xù)，肺泡壁完整。模型組則可見支氣管黏膜充血水腫，上皮細(xì)胞變性壞死糜爛脫落，支氣管周圍大量慢性炎性細(xì)胞浸潤；肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴(kuò)大，間隔變薄、斷裂，肺泡擴(kuò)大融合形成大的囊腔。痰熱清組與模型組相比，支氣管黏膜上皮細(xì)胞變性壞死以及炎細(xì)胞浸潤程度均明顯減輕，肺大泡數(shù)量減少。提示痰熱清注射液能減輕炎癥反應(yīng)程度，還可減輕危險(xiǎn)因素對(duì)肺泡結(jié)構(gòu)的破壞 (圖1)。

2.3 AB-PAS染色觀察

正常組大鼠肺組織病理切片未見支氣管黏膜含有紫紅色顆粒的杯狀細(xì)胞。在模型組大鼠肺組織病理切片中，則可見支氣管黏膜上皮含有較多杯狀細(xì)胞。痰熱清組大鼠肺組織與模型組相比，支氣管黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞明顯減少(結(jié)果見圖2)。黏液PAS反應(yīng)陽性，鏡下呈現(xiàn)紫紅色，模型組、痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積均大于正常組，痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積明顯小于模型組(表2)，提示痰熱清注射液能抑制杯狀細(xì)胞化生，減少黏液分泌。

圖1 HE染色各組肺組織病理切片(100 ×)

注：A.正常組；B.模型組；C.痰熱清組

圖2 AB-PAS染色各組肺組織病理切片(400 ×)

注:與正常組相比，其余兩組陽性面積較大，aP<0.001，bP=0.048；與模型組相比，痰熱清組面積較小，cP=0.027；以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.4 MUC5AC mRNA表達(dá)程度

肺組織中MUC5AC mRNA表達(dá)比較，痰熱清組2-△△CT值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 肺組織中MUC5AC mRNA比較

3 討論

氣道黏液高分泌是COPD的主要特征，也是其急性發(fā)作和預(yù)后變差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)此進(jìn)行針對(duì)性治療具有重要意義。一方面，存在氣道黏液高分泌和反復(fù)發(fā)作的患者FEV1下降程度更嚴(yán)重[8]；氣道黏液高分泌使得病原體定植及氣道阻塞加重，進(jìn)而使COPD急性發(fā)作頻率和病死率升高[9-10]。另一方面，針對(duì)氣道病理性黏液的治療可改善COPD的癥狀、減少發(fā)作頻率、減緩疾病進(jìn)展[11]。因此，在慢性阻塞性肺病的評(píng)估與治療方面，應(yīng)充分考慮氣道黏液高分泌的重要作用[12]。

氣道黏液高分泌的產(chǎn)生與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶失衡和膽堿能神經(jīng)功能紊亂等多種病理生理機(jī)制有關(guān)。數(shù)種機(jī)制的中間關(guān)鍵環(huán)節(jié)均為對(duì)MUC基因表達(dá)的調(diào)控。IL-1β可通過與其受體IL-1R結(jié)合增強(qiáng)環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)活性，進(jìn)而通過環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)通路上調(diào)MUC基因表達(dá)。TNF-α可活化NF-κB，隨之NF-κB移入細(xì)胞核，使得MUC基因表達(dá)上調(diào)。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophi elastase,NE)可通過蛋白酶激活受體2(protease activated receptor-2,PAR2)增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，由此激活蛋白激酶C (protein kinases-C,PKC)，進(jìn)一步導(dǎo)致MUC5AC的分泌[13]。抑制NE的藥物可降低MUC的轉(zhuǎn)錄水平[14]，也說明了NE對(duì)MUC基因存在調(diào)控作用。上述多種機(jī)制導(dǎo)致MUC基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致杯狀細(xì)胞增生/化生，黏蛋白分泌增加。在慢性氣道炎癥性疾病中，病理性黏蛋白分泌增加，主要表型是MUC5AC，同時(shí)杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的黏蛋白MUC5AC 被認(rèn)為是該細(xì)胞增生的標(biāo)志[15]；在COPD急性發(fā)作期MUC5AC mRNA表達(dá)水平顯著增高。COPD急性加重時(shí)，杯狀細(xì)胞分泌為主的、過度的MUC5AC表達(dá)具有突出病理意義[16]。

氣道黏液高分泌屬于中醫(yī)“痰熱壅肺證”范疇，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)痰熱清注射液在治療慢性阻塞性肺疾病急性加重時(shí)可取得較好的療效[17-18]，但其發(fā)揮清熱化痰功效的機(jī)理尚未明確。因此，本研究通過觀察MUC5AC mRNA表達(dá)及肺組織杯狀細(xì)胞增生程度，探討痰熱清注射液清熱化痰的效應(yīng)機(jī)制和對(duì)氣道黏液高分泌的影響。

本研究模型大鼠肺組織RT-PCR檢測結(jié)果顯示，痰熱清組的MUC5AC表達(dá)低于模型組，提示痰熱清注射液可以抑制MUC5AC mRNA的表達(dá)，說明痰熱清注射液可能通過調(diào)節(jié)MUC5AC mRNA的表達(dá)，抑制氣道黏液高分泌，改善氣道阻塞。

本研究中肺組織AB-PAS染色病理切片觀察結(jié)果顯示，與模型組相比，痰熱清組大鼠肺組織的杯狀細(xì)胞明顯減少；痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積明顯小于模型組，說明在痰熱清注射液的干預(yù)下，杯狀細(xì)胞化生減少、增生程度降低，黏液分泌減少。因此，通過對(duì)MUC5AC mRNA表達(dá)的下調(diào)來減輕杯狀細(xì)胞增生/化生以及抑制氣道黏液高分泌，是痰熱清注射液“清熱化痰”效應(yīng)產(chǎn)生的可能作用環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，痰熱清注射液清熱化痰，使得肺氣宣發(fā)肅降無所阻礙，則咳止喘平。本研究展現(xiàn)了其作為COPD氣道黏液高分泌針對(duì)性治療藥物的潛力，為基于“清熱化痰”的氣道黏液高分泌治療研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，痰熱清注射液干預(yù)氣道黏液高分泌的其他機(jī)制有待研究；其干預(yù)MUC5AC mRNA的上游機(jī)制尚未明確。清熱化痰藥物調(diào)控MUC5AC的多種分子通路的作用可能將成為下一步研究的熱點(diǎn)。

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The Effect of Tanreqing Injection on the Airway Mucus Hypersecretion of COPD Rats

CaiLingfeng1,WangHuixian2,LinGuankang3,HuangDonghui2△.

1.GuangzhouUniversityofTCM,Guangzhou510000,China; 2.DepartmentofRespiratory,ZhuhaiBranchHospitalofGuangdongHospitalofTCM,Zhuhai519000,China; 3.DepartmentofRespiratory,GuangzhouHospitalofIntegratedTCMandWesternMedicine,Guangzhou510000,China

Objective To investigate the effect of Tanreqing injection on the airway mucus hypersecretion in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and explore the effect mechanism of “clearing heat and dissipating phlegm”. Methods 60 SD rats were randomly divided into the normal group, model group and experiment group, and each group consists of 20 rats. The models of COPD rats were established by means of cigarette smoking and tracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS). The normal and model groups were given saline via intraperitoneal injection once per day from the 41st day to the 50th day of the experiment, while the experiment group was given Tanreqing injection once per day on the corresponding days. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was adopted to measure the gene expression levels of MUC5AC mRNA of the rats′ lung tissues, and the pathological section of these lung tissues were observed. Results The RT-PCR results showed that the expression levels of MUC5AC mRNA were significantly lower in the experiment group than in the model group (P<0.05). The results of HE staining showed that the rupture of alveolar wall, expansion of alveolar space, alveolar fusion, and infiltration of inflammation cells were observed in the model group. The results of alcian blue-periodic acid schiff stain (AB-PAS) showed that the goblet cells of the bronchial epithelium in the experiment group decreased significantly (P<0.05) and the positive staining areas of AB-PAS were also significantly smaller in the experiment group than in the model group. Conclusion Tanreqing injection can inhibit the expression levels of MUC5AC mRNA in the models of COPD rats, which can probably relieve their airway mucus hypersecretion and ameliorate their airway obstruction.

Tanreqing injection; Chronic obstructive pulmonary disease; Airway mucus hypersecretion; MUC5AC mRNA

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.003

廣東省科技計(jì)劃自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(No：00462830227154043)

R285.5

A

△通信作者：黃東暉，E-mail:13600001163@139.com