ER、PR、CD34、P16在乳腺葉狀腫瘤中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性分析

賈 翠，韓邦彩，何 飛，張錄順△

1.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院(成都 610500))

·論 著·

ER、PR、CD34、P16在乳腺葉狀腫瘤中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性分析

賈 翠1，韓邦彩2，何 飛2，張錄順1△

1.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院(成都 610500))

目的 通過分析常規(guī)組織學(xué)、免疫組織化學(xué)蛋白表達(dá)，探討有助于乳腺葉狀腫瘤(phyllodes tumors，PTs)預(yù)后判斷的指標(biāo)。 方法 回顧性分析79例乳腺PTs病例的組織學(xué)特點(diǎn)，以59例乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤病例作為對照，免疫組織化學(xué)檢測ER、PR、CD34、P16表達(dá)，并隨訪，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其相關(guān)性。結(jié)果 79例乳腺PTs按半定量指標(biāo)進(jìn)行分級，良性、交界性和惡性PTs分別占58.2%、29.1%和12.7%。隨訪結(jié)果表明，乳腺PTs病例的局部復(fù)發(fā)率為20.0%(14/70)，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為24個月。乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤的局部復(fù)發(fā)率為9.8%(5/51)，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為45個月。ER、PR在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤的間葉性腫瘤細(xì)胞中均未見表達(dá)。CD34在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤中的陽性率分別為57.0%、89.8%；P16在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤中的陽性率分別為53.1%、23.7%。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。預(yù)后分析顯示，CD34陽性率與乳腺PTs病例局部復(fù)發(fā)有顯著相關(guān)性(P=0.001)。結(jié)論 CD34和P16有助于乳腺PTs和乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤的鑒別診斷，CD34是預(yù)測乳腺PTs預(yù)后有價(jià)值的指標(biāo)。

乳腺腫瘤； 葉狀腫瘤； 纖維腺瘤； 預(yù)后

乳腺纖維上皮性腫瘤包括一組從良性到惡性的乳腺雙相性腫瘤，基于組織學(xué)特征分為：乳腺成人型纖維腺瘤、幼年型纖維腺瘤、復(fù)雜型纖維腺瘤和乳腺葉狀腫瘤(phyllodes tumors，PTs)。幼年型纖維腺瘤多見于青春期女性，其中少數(shù)(<5%)體積巨大的腫瘤也稱為巨大纖維腺瘤，組織學(xué)上間質(zhì)細(xì)胞較豐富，常見導(dǎo)管內(nèi)上皮增生，研究[1]將此類腫瘤命名為細(xì)胞型纖維腺瘤。乳腺PTs較為少見，占乳腺原發(fā)腫瘤的0.3%～1.5%，占乳腺纖維上皮性腫瘤的2.5%[2]。乳腺PTs很難和纖維腺瘤相鑒別，尤其是管內(nèi)型纖維腺瘤和細(xì)胞型纖維腺瘤，二者的臨床處理方式和預(yù)后也不一致，因此需要準(zhǔn)確鑒別。有關(guān)乳腺PTs和纖維腺瘤的起源和相關(guān)性一直是研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)，但目前有關(guān)這方面的研究報(bào)道不多[3-4]。乳腺PTs的正確診斷非常重要，其預(yù)后判斷也是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。復(fù)發(fā)是乳腺PTs的主要問題之一，目前對于PTs復(fù)發(fā)的相關(guān)因素從腫瘤大小、手術(shù)方式、免疫組化、分子遺傳學(xué)等多方面的研究[5-6]報(bào)道結(jié)果不一，甚至互相矛盾。本研究收集了79例乳腺PTs和59例富細(xì)胞型纖維腺瘤病例，通過觀察組織學(xué)特點(diǎn)、免疫組化檢測蛋白表達(dá)，旨在找出二者的鑒別診斷指標(biāo)；并通過隨訪尋找乳腺PTs潛在的預(yù)后指標(biāo)，同時(shí)通過對二者的對比分析，進(jìn)一步認(rèn)識乳腺雙相性腫瘤。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2001-2014年在四川省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的乳腺PTs病例，經(jīng)兩位乳腺病理醫(yī)師復(fù)核閱片，最終確定診斷79例，其中良性、交界性和惡性分別為46例(58.2%)、23例(29.1%)和10例(12.7%)。通過四川省人民醫(yī)院倫理委員會同意，查閱患者的臨床病理資料并隨訪?；颊呔鶠榕浴Ｈ橄貾Ts患者平均年齡40歲，乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤患者平均年齡27歲。兩組患者病程從數(shù)天至30年，大部分病程在2年內(nèi)。大體上，良性、交界性和惡性PTs差異不明顯，大多數(shù)腫瘤呈結(jié)節(jié)狀生長，界限清楚，良性和交界性PTs常見寬大的裂隙或舌狀突起形成的典型葉狀結(jié)構(gòu)。就診時(shí)乳腺PTs和乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤病例腫瘤平均大小分別為4.4、3.1 cm，二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P=0.066)。

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)乳腺PTs分級指標(biāo) 2012年第四版WHO乳腺腫瘤病理診斷藍(lán)皮書[7]提供了6個組織學(xué)指標(biāo)[1]：腫瘤邊界狀況、間葉細(xì)胞的豐富程度、間葉細(xì)胞的異型性、間葉細(xì)胞的核分裂象、有無間質(zhì)過度增生以及有無惡性異源性成分。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 根據(jù)常規(guī)HE染色切片，所有病例均挑選有代表性的蠟塊做免疫組化分析，并確保選取的組織中有正常乳腺組織作為內(nèi)對照。各塊石蠟包埋組織切取4 μM厚的免疫組化空白切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，高壓修復(fù)2 min，加入一抗ER-α(SP1，1∶200)、PR(PgR636，1∶300)、CD34(QBEnd/10，1∶200)和P16(16P04/J02，1∶100)， 均購自Dako公司，修復(fù)液EDTA-Tris緩沖液pH9.0，于4 ℃孵育過夜，EnVision二抗(Dako，工作液)37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以 TBS 緩沖液代替一抗作為空白對照。判定染色的標(biāo)準(zhǔn)為：ER和PR陽性信號位于胞核，CD34陽性信號位于胞漿，P16陽性信號位于胞核或胞漿。上述抗體的陽性對照染色強(qiáng)度均記為2+；待測腫瘤細(xì)胞無信號記為0，弱于對照記為1+，等于記為2+， 強(qiáng)于記為3+；估算陽性區(qū)域的百分比：0和1+判為陰性，≥20% 2+或3+判為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析組間差異，用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素的RFS生存分析,無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival，RFS)定義為從術(shù)后診斷PTs到第1次復(fù)發(fā)的間隔時(shí)間。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

免疫組化標(biāo)記共138例，乳腺良性、交界性和惡性PTs病例分別為46、23和10例(圖1A)。乳腺細(xì)胞型纖維腺瘤病例59例(圖1B)。對10例惡性PTs的病例進(jìn)行上皮和肌上皮標(biāo)記結(jié)果：間質(zhì)細(xì)胞的CK5/6、CK混、34βE12、Desmin及P63均為陰性，確定乳腺惡性PTs的診斷。

2.1.1 CD34 CD34陽性信號在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤內(nèi)均呈條帶狀分布(圖2A～2D)。乳腺PTs組的CD34陽性率為57.0%，富細(xì)胞型纖維腺瘤為89.8%，U檢驗(yàn)結(jié)果顯示,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=18.246，P<0.001)。乳腺良性PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.413，P=0.128)。而乳腺惡性PTs中陽性率為30%，多為弱到中陽性，陽性表達(dá)明顯低于良性和交界性PTs，但在乳腺交界性和惡性PTs中CD34表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.470，P=0.045)(表1)。

圖1 乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤的組織學(xué)表達(dá)

注：A:良性PTs，細(xì)胞密度不一(40×)； B：富細(xì)胞型纖維腺瘤，可見類似葉狀結(jié)構(gòu)(200×)

圖2 CD34在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤中的表達(dá)

注:A：良性PTs，間質(zhì)細(xì)胞胞漿可見CD34陽性表達(dá)(100×)；B：交界性PTs，上皮周圍的間質(zhì)細(xì)胞胞漿可見CD34陽性表達(dá)(100×)；C：惡性PTs，間質(zhì)細(xì)胞胞漿CD34未表達(dá)(200×)；D：乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤，間質(zhì)細(xì)胞胞漿CD34陽性表達(dá)(100×)

表1 CD34在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤中的表達(dá)和分布情況比較[n(%)]

2.1.2 P16 P16主要表達(dá)于乳腺PTs上皮下間質(zhì)腫瘤細(xì)胞陽性明顯(圖3A～3C)。乳腺PTs組P16陽性率為53.1%，多為中～強(qiáng)陽性表達(dá)；富細(xì)胞型纖維腺瘤組陽性率為23.7%，多為弱～中陽性(圖2D)。U檢驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺PTs組和富細(xì)胞型纖維腺瘤組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=16.405，P=0.001)；富細(xì)胞型纖維腺瘤和良性、交界性PTs間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=13.934、11.500，P=0.003、0.005)(表2)。

圖3 P16在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤中的表達(dá)

注:A：良性PTs，間質(zhì)細(xì)胞可見細(xì)胞核P16陽性表達(dá)(200×)； B：交界性PTs，上皮周圍的間質(zhì)細(xì)胞可見細(xì)胞核P16陽性表達(dá)(200×)；C：惡性PTs，間質(zhì)細(xì)胞可見細(xì)胞核P16陽性表達(dá)(200×)；D：富細(xì)胞型纖維腺瘤，間質(zhì)細(xì)胞可見個別P16陽性表達(dá)細(xì)胞(200×)

表2 P16在乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤中的表達(dá)和分布情況比較[n(%)]

2.1.3 ER-α，PR ER-α，PR上皮陽性常見，間質(zhì)腫瘤細(xì)胞未見陽性。

2.2 隨訪和預(yù)后

通過電話或信件隨訪。乳腺PTs病例共79例， 70例獲得隨訪結(jié)果，9例失訪，回訪率為88.6%；隨訪時(shí)間21～168個月，中位隨訪期為65個月。富細(xì)胞型纖維腺瘤病例共59例，隨訪51例，8例失訪，回訪率86.4%，隨訪時(shí)間24～72個月。

診斷為乳腺PTs后，患者的局部復(fù)發(fā)率為20.0%(14/70例),其中良性7/41例(17.1%)，交界性4/19例(21.1%)，惡性3/10例(30.0%)，復(fù)發(fā)時(shí)間7～78個月，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為24個月，65%病例術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)。不同分級的乳腺PTs復(fù)發(fā)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤組復(fù)發(fā)率為9.8%(5/51例)，與乳腺PTs組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.534，P=0.011)。中位復(fù)發(fā)時(shí)間為47個月。

單因素生存分析結(jié)果顯示，CD34與乳腺PTs病例的RFS有關(guān)(P<0.01)(圖4)。P16未見有預(yù)后提示意義。

圖4 CD34在乳腺PTs中的表達(dá)與患者預(yù)后(RFS)的關(guān)系

3 討論

目前，乳腺PTs分級診斷是基于WHO推薦的6個組織學(xué)指標(biāo)的綜合評估。不同文獻(xiàn)報(bào)道的乳腺PTs病例比例略有差異，良性、交界性和惡性PTs占比分別為60%～75%、13%～26%、10%～20%[7]。本組病例中，良性、交界性和惡性PTs占比分別為58.2%、29.1%和12.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道相仿[7]。乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤和PTs都是由上皮和間質(zhì)組成的雙相性腫瘤，其組織學(xué)起源于小葉內(nèi)和導(dǎo)管周圍間質(zhì)。在進(jìn)行乳腺PTs分級診斷時(shí)，對于細(xì)胞豐富而邊界清楚的一類腫瘤究竟納入乳腺PTs還是富于細(xì)胞性纖維腺瘤或幼年型纖維腺瘤，非常困難。因此，筆者從免疫組化的角度出發(fā)，試圖找出有助于乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤鑒別診斷的輔助指標(biāo)。

本研究數(shù)據(jù)顯示，89.8%的乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤病例CD34陽性，乳腺PTs病例表達(dá)降低，惡性PTs陽性率僅為30.0%，明顯低于良性和交界性(63.0%和56.5%)。Lee等[8]匯總了100例乳腺梭形細(xì)胞癌、纖維瘤病和PTs的間質(zhì)梭形細(xì)胞CD34表達(dá)情況, CD34在乳腺正常小葉內(nèi)間質(zhì)表達(dá),惡性PTs的間質(zhì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)明顯降低(25.0%)，良性和交界性為80.0%，梭型細(xì)胞癌和纖維瘤病間質(zhì)不表達(dá)。另外對33例乳腺PTs研究發(fā)現(xiàn)，CD34在良性PTs中陽性率為85.7%(18/21)，惡性PTs陽性率為16.7%(1/6),交界性PTs陽性率為100%。筆者認(rèn)為CD34可作為鑒別乳腺PTs和富細(xì)胞型纖維腺瘤的指標(biāo)，同時(shí)也是鑒別良、惡性PTs的有效輔助指標(biāo)，但并不能鑒別良性和交界性PTs。CD34在乳腺纖維上皮性腫瘤中的高表達(dá)也提示其間質(zhì)的梭形細(xì)胞可能起源于乳腺小葉內(nèi)或?qū)Ч苤車g質(zhì)。乳腺PTs中CD34的表達(dá)低于富細(xì)胞型纖維腺瘤，惡性PTs中CD34表達(dá)明顯減少，可能與這種成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的分化程度降低或有其他方向的轉(zhuǎn)化有關(guān)。少量乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤病例P16陽性表達(dá)，在乳腺PTs間質(zhì)的腫瘤細(xì)胞中P16陽性率為53.1%，高于富細(xì)胞型纖維腺瘤(23.7%)，但良、惡性PTs并未見差異。乳腺PTs中P16表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚。

乳腺富細(xì)胞型纖維腺瘤的局部復(fù)發(fā)率為9.8%，乳腺PTs局部復(fù)發(fā)率為20.0%，良性、交界性和惡性PTs復(fù)發(fā)率分別為17.1%、21.1%、30.0%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，65%的病例術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)。既往研究顯示，腫瘤大小(>5 cm)、手術(shù)方式、切緣陽性[10]、間質(zhì)過度增生[11]、核分裂像(≥15/10HPF)[12]、腫瘤細(xì)胞異型性[13]、腫瘤性壞死以及浸潤性邊界[14]等可能是與乳腺PTs復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床和組織學(xué)特點(diǎn)。CD34和預(yù)后的關(guān)系鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，CD34陰性的乳腺PTs病例更易發(fā)生局部復(fù)發(fā)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1702.046.html

A Study on the Expression of ER, PR, CD34, P16 in Breast Phyllodes Tumors and their Correlation with Prognosis

JiaCui1,HanBangcai2,HeFei2,ZhangLushun1△.

1.DepartmentofPathology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofClinicalMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To analyze the characteristics of protein expressions by the histological and immunohistochemical methods respectively and explore the indexes to evaluate the prognosis of breast phyllodes tumors (PTs). Methods The histological characteristics of 70 cases with breast PTs were reviewed retrospectively and compared with those of the other 59 cases with cellular fibroadenoma. The immunehistochemical staining was used to assess the expressions of ER, PR, CD34 and P16, and the follow-ups were conducted. Then the analyses were made statistically. Results According to the semi-quantitative index recommended by WHO, 58.2% of PTs in the 79 cases were benign tumors, 29.1% were borderline tumors, and 12.7% were malignant tumors. The results of the follow-ups showed that the recurrence rates of 70 cases with PTs and 59 cases with cellular fibroadenoma were 20.0% (14/70) and 9.8% (5/51) respectively, and their median time of recurrence was 24 months and 45 months respectively. There were no positive expressions of ER and PR in the PTs and the mesenchymal tumors of cellular fibroadenoma. The positive rates of CD34 in PTs and cellular fibroadenoma were 57.0% and 89.8% respectively, and those of P16 were 53.1% and 23.7% respectively. The statistical analysis showed that the differences were significant between the two groups (P<0.05). The prognostic analysis showed that the positive rate of CD34 was correlated significantly with the recurrence of breast PTs (P=0.001). Conclusion CD34 and P16 are helpful for the differential diagnosis of breast PTs and cellular fibroadenoma, and CD34 is a valuable index to evaluate the prognosis of PTs.

Breast tumor; Phyllodes tumor; Fibroadenoma; Prognosis

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161207.1048.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No:81401161);成都醫(yī)學(xué)院校基金項(xiàng)目((No:13Z094)

R737.9

A

△通信作者：張錄順，E-mail: 45194424@qq.com