熟地黃多糖含量測定方法研究

吳詩云，鐘益寧，張 焱，柳 歡，楊麗聲，梁禮群

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530299)

熟地黃多糖含量測定方法研究

吳詩云，鐘益寧*，張 焱，柳 歡，楊麗聲，梁禮群

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530299)

[目的]建立熟地黃中多糖含量的測定方法。[方法]利用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)分別測定熟地黃中的多糖含量，對檢測結(jié)果進行比較。[結(jié)果]苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的平均回收率分別為100.5%、99.8%、100.6%，RSD分別為1.6%、1.6%、1.5%，測得的多糖質(zhì)量分數(shù)分別為14.80、14.66、17.46 mg/g。[結(jié)論]苯酚硫酸法的結(jié)果更可靠，且操作相對簡單易行，可考慮作為熟地黃多糖含量測定的首選方法。

熟地黃；多糖；含量測定；苯酚硫酸法；蒽酮硫酸法；3，5-二硝基水楊酸法

熟地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的新鮮或干燥塊根經(jīng)酒燉或蒸法加工炮制而成的[1]。熟地黃多糖是熟地黃的有效成分之一，具有增強機體造血、提高免疫力以及抗氧化等作用[2-6]。當前研究對多糖的測定方法主要是以葡萄糖為對照品的比色法，其中包括苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)。苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法是利用多糖在濃硫酸的作用下生成糠醛或羥甲基糠醛，然后與顯色劑反應在特定的波長處有最大吸收。而3，5-二硝基水楊酸法是3，5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性的條件下與還原糖反應生成棕紅色的氨基化合物，然后分別通過測定總糖和單糖的質(zhì)量分數(shù)來計算多糖的含量。目前針對熟地黃多糖含量測定方法的選擇并沒有系統(tǒng)的定論，如何選擇經(jīng)濟、簡單的方法準確測定熟地黃中多糖的含量成為當前的熱點問題。筆者采用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法對熟地黃中多糖進行含量測定，通過對比3種方法，選定適合測定熟地黃中多糖含量的比色方法，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。熟地黃購于老百姓大藥房。

1.1.2 試劑。葡萄糖、乙醇、苯酚、蒽酮、酒石酸鉀鈉、濃硫酸均為分析純，3，5-二硝基水楊酸為化學純，國藥集團化學試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水。

1.1.3 儀器。8453紫外可見分光光度計(美國安捷倫)；電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 蒽酮硫酸試劑的配制。取0.1 g蒽酮，加入100 mL 80%硫酸溶解，即得蒽酮硫酸試液。

1.2.1.2 DNS試劑的配制。甲液：6.9 g結(jié)晶苯酚溶解于15.2 mL 100 g/L的NaOH溶液中，并用蒸餾水稀釋至69 mL，再加入6.9 g亞硫酸鈉；乙液：稱取255.0 g酒石酸鉀鈉，加到300 mL 100 g/L的NaOH溶液中，再加入10 g/L的DNS溶液880 mL。再將甲乙溶液混合得黃色試劑，儲存于棕色瓶中，置室溫下7 d后備用[7]。

1.2.1.3 葡萄糖對照品溶液的配制。精密稱量葡萄糖對照品0.025 2 g，置于250 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度。

1.2.1.4 供試品溶液的制備。稱取約5 g熟地黃置于圓底燒瓶中，加入100 mL水，水浴回流1 h，重復2次。過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至100 mL，加入無水乙醇至含醇量80%，靜置24 h，抽濾所得濾渣用無水乙醇洗滌多次后干燥，得到粗多糖；所得粗多糖用蒸餾水完全溶解后定容至250 mL。DNS法單糖樣品是精密量取上述樣品5.0 mL置于50 mL磨口三角燒瓶中，加入濃鹽酸20 mL，搖勻后加塞于100 ℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫；加入酚酞指示液，用氫氧化鈉溶液調(diào)至微紅色，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容。

1.2.2 最大吸收波長的選擇。取葡萄糖對照品和熟地黃多糖樣品分別用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法和DNS法顯色后，用紫外可見分光光度計于200～800 nm進行全波長掃描。

1.2.3 標準曲線的繪制。

1.2.3.1 苯酚硫酸法。精密吸取葡萄糖對照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，置具塞刻度試管中，分別加水至2.0 mL，精密加入1.4 mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入7.0 mL濃硫酸，補水至10 mL，搖勻后放置10 min。以相應試劑為空白，在最大吸收波長處測定相應的吸光度值。以吸光度為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.2 蒽酮硫酸法。精密吸取葡萄糖對照品溶液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL，置具塞刻度試管中，分別加水至2.0 mL，精密加入6.0 mL蒽酮硫酸試液。搖勻后于100 ℃水浴加熱15 min，取出后迅速冷卻至室溫。以相應試劑為空白，在最大吸收波長處測定相應的吸光度值。以吸光度為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3.3 DNS法。精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置具塞刻度試管中，分別加水至6.0 mL，精密加入2.0 mL DNS試液。搖勻后于100 ℃水浴加熱5 min，取出后迅速冷卻至室溫。以相應試劑為空白，在最大吸收波長處測定相應的吸光度值。以吸光度為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4 精密度試驗。精密吸取葡萄糖對照品0.6 mL和供試品溶液0.2 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.1”方法操作；精密吸取葡萄糖對照品1.0 mL和供試品溶液0.5 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.2”方法操作；精密吸取葡萄糖對照品1.0 mL、總糖樣品5.0 mL和單糖樣品1.0 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.3”方法操作；分別在相應波長下連續(xù)測定其吸光度值6次，通過計算得到各方法相應的RSD值。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.4”方法操作后，在相應波長下，每間隔10 min測定1次，3次后每間隔30 min再測定1次，共測定7次。計算各方法相應的RSD值。

1.2.6 重復性試驗。精密稱取6份熟地黃5 g，按照“1.2.1.4”方法制備各供試品溶液，精密吸取各供試品溶液0.2 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.1”方法操作；精密吸取各供試品溶液0.5 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.2”方法操作；精密吸取各總糖樣品5.0 mL和單糖樣品1.0 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.3”方法操作；分別在相應波長下測定吸光度值，計算各方法相應的RSD值。

1.2.7 加樣回收試驗。稱取熟地黃樣品約2.5 g，共9份，精密稱定，分別準確加入10、20、30 mL 0.100 8 mg/mL葡萄糖對照品，按照“1.2.1.4”方法制備各供試品溶液，再對應“1.2.3”中各方法操作后測定其吸光度值，計算回收率。

1.2.8 樣品中多糖含量測定。精密稱取3份熟地黃5 g，按照“1.2.1.4”方法制備各供試品溶液，精密吸取各供試品溶液0.2 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.1”方法操作；精密吸取各供試品溶液0.5 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.2”方法操作；精密吸取各總糖樣品5.0 mL和單糖樣品1.0 mL，分別置于具塞刻度試管中，按照“1.2.3.3”方法操作；然后分別在相應波長下測定吸光度值。利用標準曲線計算熟地黃樣品的多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇 由圖1可見，苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的最大吸收波長分別為489、624、510 nm。其中對于蒽酮硫酸法在419 nm處有一個較大吸收峰，通過文獻[8]可知，利用蒽酮硫酸法測植物多糖其最大吸收波長為562～630 nm，故選取624 nm。

注：1為熟地黃多糖樣品；2為葡萄糖對照品；3為熟地黃單糖樣品。Note：1.Polysaccharide samples of Radix Rehmanniae Preparata.；2.Glucose reference substance；3.Monosaccharide samples of Radix Rehmanniae Preparata..圖1 苯酚硫酸法(a)、蒽酮硫酸法(b)和DNS法(c)吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of phenolic-sulfuric acid method(a)，anthrone-sulfuric acid method(b)and DNS method(c)

2.2 標準曲線的繪制 根據(jù)“1.2.3”項下各個測定結(jié)果，以吸光度為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得出苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的回歸方程分別為y=107.11x-0.182 4(r=0.999 41)、y=26.71x+ 0.046(r=0.998 99)、y=7.103x+0.098(r=0.998 49)，表明3種方法分別在0.004 016～0.009 036、0.010 08～0.025 20、0.012 6～0.075 6 mg/mL，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度值有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗 經(jīng)計算，苯酚硫酸法對照品、供試品溶液的相應RSD值分別為0.16%、0.03%；蒽酮硫酸法對照品、供試品溶液的相應RSD值分別為0.09%、1.04%；DNS法對照品、單糖、總糖的相應RSD值分別為0.13%、0.39%、0.03%，表明儀器的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗 按照“1.2.5”項下，在0、10、20、30、60、90、120 min測定吸光度值，定量計算含量后計算相應的RSD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯酚硫酸法對照品、供試品溶液的相應RSD值分別為0.96%、0.69%；蒽酮硫酸法對照品、供試品溶液的相應RSD值分別為1.34%、0.64%；DNS法對照品、單糖、總糖的相應RSD值分別為0.34%、1.17%、0.48%，表明3種方法對照品和供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復性試驗 用3種方法平行測定6份樣品的含量，計算相應的RSD值分別為：苯酚硫酸法2.29%、蒽酮硫酸法0.54%、DNS法2.12%，表明這3種方法的重復性良好。

2.6 加樣回收試驗 由表1～3可見，苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的平均回收率分別為100.5%、99.8%、100.6%，RSD分別為1.6%、1.6%、1.5%，可見3種方法的回收率和RSD均較理想。

表1 苯酚硫酸法的加樣回收率考察結(jié)果

表2 蒽酮硫酸法的加樣回收率考察結(jié)果

表3 DNS法的加樣回收率考察結(jié)果

2.7 樣品中多糖含量測定 按照“1.2.8”操作，利用標準曲線計算熟地黃樣品的多糖含量，得出苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法測定熟地黃樣品的多糖含量分別為14.80、14.66、17.46 mg/g。

3 結(jié)論與討論

該試驗利用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)分別測定熟地黃中的多糖含量，計算得到多糖質(zhì)量分數(shù)分別為14.80、14.66、17.46 mg/g；方法學考察試驗結(jié)果表明，3種方法均有較好的穩(wěn)定性、重復性和回收率。同時，將相同質(zhì)量濃度的葡萄糖對照品用3種方法分別顯色后測定其吸光度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯酚硫酸法的吸光度值最大，表明3種方法中苯酚硫酸法的靈敏度最高。

該試驗利用水提醇沉法提取熟地黃中的粗多糖，然后進一步利用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法和DNS法對其進行含量測定，在一定程度上能夠排除單糖及其他水溶性成分的影響；利用DNS法測定單糖時吸光度很小，原因也很可能是在利用水提醇沉法提取多糖時，已經(jīng)除去這些雜質(zhì)，從而消除其影響。因此在用DNS法測熟地黃多糖時優(yōu)勢并不明顯。

苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法測多糖含量時，試驗結(jié)果接近，均能準確測定熟地黃中多糖含量。但這與崔瑛等[9]、曲丹等[10]研究的熟地黃多糖含量差異很大，可能是因為炮制方法的差異而造成的。從該試驗各方面數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，采用苯酚硫酸法操作更簡單易行，因此在測量熟地黃多糖含量時可優(yōu)先考慮苯酚硫酸法。參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：125-126.

[2] 黃霞，劉杰，劉惠霞.熟地黃多糖對血虛模型小鼠的影響[J].中國中藥雜志，2004，29(12)：1168-1170.

[3] 李發(fā)勝，徐恒瑰，李明陽，等.熟地多糖提取物對小鼠免疫活性影響[J].中國公共衛(wèi)生，2008，24(9)：1109-1110.

[4] 苗明三，孫艷紅，方曉艷.(懷)熟地黃多糖抗氧化作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，9(10)：32-33.

[5] 劉朵，章丹丹，卞卡.地黃藥理藥化及配伍研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23(3)：748-750.

[6] 管斯琪，陳培豐，祝雨田，等.熟地黃多糖對阿霉素致小鼠骨髓抑制及免疫功能損傷的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2014，38(3)：312-315.

[7] 唐冰，夏秋瑜，李從發(fā)，等.NAG含量測定中常見的3種DNS試劑使用效果比較研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2006，26(2)：33-35.

[8] 蘇玉順，李艷君，趙方振，等.紫外-可見分光光度法在植物多糖含量測定中的應用[J].光譜實驗室，2011，28(3)：1101-1107.

[9] 崔瑛，王曉寧，劉菊.熟地黃粗多糖提取與初步純化工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(10)：2570-2571.

[10] 曲丹，王東，衣思佳，等.熟地黃總多糖含量分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2008，10(5)：150-151.

Study on the Determination Methods of Polysaccharide Content ofRadixRehmanniaePreparata.

WU Shi-yun,ZHONG Yi-ning*,ZHANG Yan et al

(Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530299)

[Objective] The research aimed to establish the determination method of polysaccharide content ofRadixRehmanniaePreparata..[Method]The polysaccharide contents ofRadixRehmanniaePreparata. were determined by phenol-sulfuric acid method, anthrone-sulfuric acid method and 3,5-dinitrosalicylic acid method (DNS method) respectively, and the test results were compared.[Result]The average recovery rates of phenol-sulfuric acid method, anthrone-sulfuric acid method and DNS method were 100.5%, 99.8% and 100.6%, respectively.The RSD were 1.6%, 1.6% and 1.5% respectively.The mass fraction of polysaccharides were 14.80, 14.66 and 17.46 mg/g, respectively.[Conclusion] The phenol-sulfuric acid method was more reliable, the operation was relatively simple, which can be considered as the preferred method of determination of polysaccharide content ofRadixRehmanniaePreparata..

RadixRehmanniaePreparata.;Polysaccharide;Content determination;Phenol-sulfuric acid method;Anthrone-sulfuric acid method;3,5-dinitrosalicylic acid method

廣西科技攻關(guān)計劃項目(桂科攻1346008-4)；廣西自然基金項目(2014GXNSFAA118271)；2014年博士研究生教育發(fā)展項目(050140002)。

吳詩云(1991- )，女，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

2016-09-23

S 567.23+9

A

0517-6611(2016)35-0154-03