山荊子葉總黃酮提取工藝研究

黃占波， 宋冬梅， 尚海巍， 劉 彬

(1.遼寧科技學(xué)院生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧本溪 117004；2.遼寧泰陽醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，遼寧本溪 117004)

山荊子葉總黃酮提取工藝研究

黃占波1， 宋冬梅2， 尚海巍1， 劉 彬1

(1.遼寧科技學(xué)院生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧本溪 117004；2.遼寧泰陽醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，遼寧本溪 117004)

[目的]優(yōu)化超聲波提取山荊子葉總黃酮的最佳工藝。[方法]以山荊子葉為材料提取總黃酮，采用單因素和正交試驗(yàn)，以提取物中總黃酮提取率為考察指標(biāo)優(yōu)化提取工藝。[結(jié)果]山荊子葉總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度50%，料液比(g∶mL)1∶25，提取時(shí)間30 min，該條件下總黃酮的提取率為14.1%。[結(jié)論]利用超聲輔助提取山荊子葉總黃酮獲得了較好的效果，可為山荊子資源的綜合利用提供參考。

山荊子葉；總黃酮；超聲提??；正交試驗(yàn)

山荊子[Malusbaccata(Linn.)Borkh.]又名山丁子、林荊子等，為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)多年生落葉喬木，廣泛分布于我國東北、華北及西南地區(qū)[1]。山荊子果實(shí)具有止吐、止瀉、防止各種感染的功能，對(duì)肺結(jié)核有一定療效，國外還將其用以治療腸道疾癌[2]，其幼葉富含多種人體必需的氨基酸，民間有將其制茶飲用的傳統(tǒng)[3-4]。研究表明，山荊子中含有豐富的多酚類、黃酮類化合物[5-7]，葉總黃酮能明顯降低糖尿病小鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，改善糖尿病小鼠空腹血糖值和口服葡萄糖耐受量水平[6]；葉提取物可調(diào)節(jié)脂肪的消化和代謝，具有減肥效果[8]；葉和果實(shí)乙醇提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性和還原力[9-10]，對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有較好的保護(hù)作用[11]，對(duì)癌細(xì)胞增殖有抑制活性[10]。目前，山荊子葉總黃酮的提取工藝研究尚少見系統(tǒng)報(bào)道，僅見山荊子果實(shí)總黃酮和抗氧化物質(zhì)的提取工藝研究[12-13]，而山荊子的果實(shí)、嫩葉均有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開發(fā)潛力巨大。因此，筆者對(duì)山荊子幼葉總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行了研究，旨在為有效利用山荊子資源提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 原料與主要試劑：山荊子嫩葉，2016年5月份采于遼寧科技學(xué)院后山，陰干；蘆丁對(duì)照品，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，均為分析純；D-101大孔吸附樹脂，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

主要儀器設(shè)備：KQ-300VBD型三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；7230G可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；CPA225D微量電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；水循環(huán)真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參考山楂葉[14]總黃酮含量測(cè)定方法，制得0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。精密量取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25.00 mL比色管中，加水至6.00 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.00 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.00 mL，混勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10.00 mL，加水定容至25.00 mL，混勻，放置15 min，以空白溶液為對(duì)照，在500 nm波長處測(cè)定吸光度(A)?；貧w方程為A=10.524C+0.005 8，R2=0.999 3。

1.2.2 樣品溶液的制備及總黃酮含量測(cè)定。將山荊子葉干燥，粉碎，過20目篩，稱取1.0 g，置100.00 mL具塞錐形瓶中，加入一定量溶劑超聲提取，提取液過濾，濾液減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至100.00 mL容量瓶中，加水定容。精密量取1.00 mL提取液于25.00 mL比色管中，按“1.2.1”方法操作，測(cè)定提取液的吸光度，由回歸方程計(jì)算總黃酮的濃度，山荊子葉中總黃酮的提取率按下式計(jì)算:

總黃酮提取率(%)=(C×V1×V2)/ (V3×m) ×100式中,C為樣品中總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)；V1為提取液的體積(100.00 mL)；V2為提取液稀釋后的體積(25.00 mL)；V3為量取提取液的體積(1.00 mL)；m為山荊子葉的取樣量(mg)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)。

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響。固定料液比(g∶mL)1∶20，超聲功率300 W，提取時(shí)間20 min，提取1次，考察提取溶劑水及20%、40%、60%、80%、100%乙醇對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響。

1.2.3.2 料液比對(duì)總黃酮提取的影響。固定提取溶劑為60%乙醇，超聲功率300 W，提取時(shí)間20 min，提取1次，考察料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響。

1.2.3.3 超聲功率對(duì)總黃酮提取的影響。固定提取溶劑為60%乙醇、料液比1∶20，提取時(shí)間20 min，提取1次，考察超聲功率120、180、240、300 W對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響。固定提取溶劑為60%乙醇，超聲功率300 W，料液比1∶20，提取1次，考察提取時(shí)間10、20、40、60、80 min對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響。

1.2.3.5 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取的影響。固定提取溶劑為60%乙醇，超聲功率300 W，提取時(shí)間20 min，料液比1∶20，考察提取次數(shù)對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定超聲功率300 W，提取1次，選取乙醇濃度、料液比及提取時(shí)間為考察因素，按L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化山荊子葉總黃酮提取工藝，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 山荊子葉總黃酮提取工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)因素水平

Table 1 L9(34)orthogonal test for technique optimization of extracting total flavonoids from the leaves ofMalusbaccata

水平Levels因素Factors乙醇濃度(A)Ethanolconc?entration∥%料液比(B)Solid?liquidratio提取時(shí)間(C)Extractiontime∥min空白(D)Blank1401∶152012501∶203023601∶25403

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響 由圖1可知，山荊子葉總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)出先升高后減小的趨勢(shì)，而在40%～80%濃度時(shí)提取率變化趨勢(shì)平緩。綜合考慮，選擇60%乙醇作為提取溶劑。

圖1 乙醇濃度對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.2 料液比對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響 由圖2可知，山荊子葉總黃酮的提取率隨著料液比中溶劑用量的增大而增加，當(dāng)料液比小于1∶20后，總黃酮的提取率變化趨勢(shì)平緩。綜合來看，料液比為1∶20可以達(dá)到提取條件要求，因此，該試驗(yàn)中選擇料液比1∶20。

圖2 料液比對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.3 超聲功率對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響 由圖3可知，山荊子葉總黃酮提取率隨超聲功率的增加呈先降低后增加趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為300 W時(shí)提取率達(dá)到最高，但由于試驗(yàn)設(shè)備的局限性，未能試驗(yàn)更高超聲功率對(duì)提取率的影響。因此，該試驗(yàn)選擇300 W作為超聲提取功率。

圖3 超聲功率對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

圖4 提取時(shí)間對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.4 提取時(shí)間對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響 由圖4可知，總黃酮提取率隨時(shí)間的延長呈先上升隨后又下降趨勢(shì)，提取時(shí)間10～20 min時(shí)上升趨勢(shì)明顯，20～60 min時(shí)上升趨勢(shì)平緩，60 min后呈下降趨勢(shì)。綜合考慮，選擇超聲提取時(shí)間為20 min。

2.5 提取次數(shù)對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮提取率增加，提取2和3次的總黃酮提取率相差不明顯，說明提取2次能夠滿足提取需要，故選擇提取次數(shù)為2次。

圖5 提取次數(shù)對(duì)山荊子葉總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of extraction times on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.6 山荊子葉總黃酮提取工藝正交試驗(yàn) 由表2可知，各因素對(duì)山荊子葉總黃酮提取效果的影響順序依次為料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間；最優(yōu)工藝條件為B3A2C2，即山荊子葉總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶25、乙醇濃度50%、提取時(shí)間30 min，在此條件下，山荊子葉總黃酮的提取率最高。

表2 山荊子葉總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 The results of orthogonal test for extracting total flavonoids from the leaves ofMalusbaccata

試驗(yàn)號(hào)TestNo．因素FactorsABCD吸光度Absorb?ance(A)提取率Extractionrate∥%111110．52010．975212220．55811．878313330．56812．115421230．58012．400522310．58712．567623120．63113．612731320．48410．120832130．52611．117933210．59512．757k111．65611．16511．90112．100k212．86011．85412．34511．870k311．33112．82811．60111．878R1．5291．6630．7440．230

2.7 最佳提取工藝的驗(yàn)證 按照試驗(yàn)確定的最工藝佳條

件，稱取山荊子葉5.00 g，做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果山荊子葉總黃酮的平均提取率為14.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%。表明通過單因素考察和正交試驗(yàn)確定的提取條件為超聲法提取山荊子葉總黃酮的最佳工藝。

3 結(jié)論與討論

山荊子果實(shí)作為傳統(tǒng)可食用資源具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，得到了人們的廣泛關(guān)注，山荊子幼葉雖然也具有豐富的資源和較高的價(jià)值，卻多是作為廢棄物，較少有人研究，造成資源的極大浪費(fèi)。該研究對(duì)山荊子葉總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最佳提取工藝為乙醇濃度50%、料液比1∶25、提取時(shí)間30 min、超聲功率300 W，此條件下總黃酮提取率為14.1%。同時(shí)，初步考察了D-101大孔吸附樹脂對(duì)山荊子葉總黃酮的吸附純化效果，以60%乙醇作為洗脫劑，最后獲得總黃酮純度達(dá)48%、得率為19.4%的山荊子葉總黃酮提取物。

山荊子葉總黃酮提取物可以應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域，作為天然的黃酮類化合物資源開發(fā)潛力較大，既可為黃酮類化合物的獲得提供新的資源，也可為山荊子的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。參考文獻(xiàn)

[1] 李育農(nóng)．蘋果屬植物種質(zhì)資源研究[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：67.

[2] 韓東秀，張志民．小興安嶺山荊子資源現(xiàn)狀與經(jīng)營對(duì)策[J]．南北橋，2009(3)：10.

[3] 哈斯巴根，耿星河，海英，等．蒙古族傳統(tǒng)飲品山荊子幼葉的氨基酸含量及其評(píng)價(jià)[J]．植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，1995(1)：53.

[4] 姜鳳．山荊子果與國光蘋果中微量元素的測(cè)定[J]．長春師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，32(4)：59-62.

[5] WANG L, WANG Z Y, LI X Y.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of phenolic antioxidants fromMalusbaccata(Linn.) Borkh. using response surface methodology[J].Journal of separation science,2013, 36(9/10):1652-1658.

[6] 李萍．蘋果屬植物葉片類黃酮的含量及多樣性研究[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[7] 丁傳波，劉璐璐，趙婷，等．山荊子葉總黃酮對(duì)糖尿病小鼠血糖、血脂的作用[J]．食品科學(xué)，2014，35(17)：226-230.

[8] WEI X, ZHAO R, SUN Y H, et al. The leaf extract ofSiberianCrabapple(Malusbaccata(Linn.)Borkh.)contains potential fatty acid synthase inhibitors[J]. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry，2009，24(1)：234-240．

[9] 丁傳波，趙婷，董嶺，等．山荊子中根皮苷和黃酮含量的測(cè)定及其乙醇提取物的抗氧化活性[J]．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，42(6)：161-167.

[10] 王璐，王振宇，李小雨，等．山荊子不同溶劑提取物的體外抗氧化及抗癌活性[J]．食品科技，2013，38(9)：201-204.

[11] 丁傳波，趙婷，李永娟，等．山荊子葉醇提物對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J]．中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(11)：1627-1628．

[12] 呂娜，劉陽，夏海洋，等．響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取山荊子抗氧化物質(zhì)工藝[J]．中國釀造，2014，33(4)：52-55.

[13] 呂娜，劉陽，崔艷艷，等．響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取山荊子總黃酮工藝[J]．中國釀造，2014，33(2)：71-74.

[14] 國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典：一部[S]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：30．

Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from the Leaves ofMalusbaccata

HUANG Zhan-bo1, SONG Dong-mei2, SHANG Hai-wei1et al

(1. School of Biological Medicine and Chemical Engineering, Liaoning Institute of Science and Technology, Benxi, Liaoning 117004; 2. Liaoning Taiyang Pharmaceutical Technology Development Co. Ltd., Benxi, Liaoning 117004)

[Objective] The optimum technology of ultrasonic extracting total flavonoids from the leaves ofMalusbaccatawas studied. [Method] With leaves ofMalusbaccataas materials to extract total flavonoids, using single factor and orthogonal test, the extraction rate of total flavonoids in the extract was used as an index, the extraction process was optimized. [Result] The optimum extraction process of total flavonoids was 50% ethanol, solid-liquid ratio (g∶mL)1∶25, extraction time 30 min, the extraction rate of total flavonoids reached 14.1%. [Conclusion] The effect of ultrasonic assisted extraction of flavonoids from the leaves ofMalusbaccatais better, which can provide reference for the comprehensive utilization of the resources ofMalusbaccata.

Leaves ofMalusbaccata; Total flavonoids; Ultrasonic extraction; Orthogonal test

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目(2016003003)；遼寧科技學(xué)院博士科研基金項(xiàng)目(1406B05)。

黃占波(1976- )，男，黑龍江綏化人，講師，博士，從事藥物化學(xué)教學(xué)與研究。

2016-10-28

S 789.4

A

0517-6611(2016)35-0116-03