糙葉敗醬堿對(duì)肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

孫志欣，張瑩

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300381)

糙葉敗醬堿對(duì)肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

孫志欣，張瑩

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300381)

目的 觀察糙葉敗醬堿對(duì)肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖的影響，探討其作用機(jī)制。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞，分別加入適量糙葉敗醬堿，使其終濃度為0、5、10、15、20、30、40μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示糙葉敗醬堿呈劑量和時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖，最終選用高于及低于半數(shù)抑制濃度的10、20μmol/L糙葉敗醬堿處理48h進(jìn)行后續(xù)研究。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A1細(xì)胞，分別加入0、10、20μmol/L糙葉敗醬堿處理48h，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞百分比及細(xì)胞凋亡率，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)p21、p53、Bax、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用Caspase-3、Caspase-8活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)二者活性(以O(shè)D值表示活性)。結(jié)果 與未加糙葉敗醬堿(0μmol/L)細(xì)胞比較，10、20μmol/L糙葉敗醬堿處理的細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比增加，凋亡率增加，p21、p53、BaxmRNA表達(dá)升高，VEGF、CDK1、Bcl-2mRNA表達(dá)降低，Caspase-3和Caspase-8活性增加，P均<0.05。結(jié)論 糙葉敗醬堿可抑制肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖，激活CDK1、p51、p53等介導(dǎo)的凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期，可能是其作用機(jī)制。

肺癌；糙葉敗醬堿；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。手術(shù)聯(lián)合放化療是肺癌的主要治療方法，但化療藥物毒副作用大，許多患者無(wú)法耐受而放棄治療[2,3]。糙葉敗醬屬于敗醬科敗醬屬植物，具有鎮(zhèn)靜、抗菌、提高免疫力等生物學(xué)活性；其化學(xué)成分主要有三萜類及其皂苷類化合物、黃酮類化合物、環(huán)稀醚萜類化合物及生物堿等。糙葉敗醬堿是從糙葉敗醬中提取的活性成分，屬于N苯甲?；奖彼?2-乙酰胺基苯丙醇酯[4,5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，糙葉敗醬堿具有抗腫瘤作用，是一種極有應(yīng)用價(jià)值的抗癌新藥[6,7]。2015年11月～2016年1月，本研究觀察了糙葉敗醬堿對(duì)肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 糙葉敗醬堿(純度95%)為本室提取，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成濃度為50 mmol/L的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存，使用前用RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞生物學(xué)研究所。CCK-8試劑盒、Caspase-3及Caspase-8活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD Bioscience公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和PrimeScript RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara公司；p21、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、Bcl-2、Bax、p53抗體和相應(yīng)二抗均購(gòu)于Santa Cruz公司。

1.2 糙葉敗醬堿實(shí)驗(yàn)濃度、作用時(shí)間確定 人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1培養(yǎng)于含10% 胎牛血青的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下孵育，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，隨機(jī)分為七組，分別加入適量糙葉敗醬堿，使其終濃度為0、5、10、15、20、30、40 μmol/L，分別于培養(yǎng)24、48 h時(shí)采用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況(具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū))，計(jì)錄各組450 nm處吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。結(jié)果顯示，糙葉敗醬堿可抑制SPC-A1細(xì)胞增殖，并且其抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。糙葉敗醬堿處理24、48 h時(shí)對(duì)SPC-A1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(27±0.016)、(16±0.023)μmol/L。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用高于及低于IC50的10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h。

1.3 糙葉敗醬堿干預(yù)及相關(guān)指標(biāo)觀察 ①細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SPC-A1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL接種于6 cm培養(yǎng)皿，分別加入0、10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，計(jì)算G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞百分比。②細(xì)胞凋亡情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SPC-A1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔接種于6孔板，分別加入0、10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h，收集各組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。③細(xì)胞p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA表達(dá)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SPC-A1細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板，分別加入0、10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h，收集細(xì)胞，采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。④細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8活性：取步驟③收集的各組細(xì)胞，采用Caspase-3、Caspase-8活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)二者活性，步驟均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各組吸光度(OD)值，以此表示Caspase-3、Caspase-8的相對(duì)活性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率 10、20μmol/L糙葉敗醬堿干預(yù)后細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比及細(xì)胞凋亡率均高于未加糙葉敗醬堿(0μmol/L)細(xì)胞(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度糙葉敗醬堿處理48 h時(shí) SPC-A1細(xì)胞周期分布和凋亡率比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與10 μmol/L比較，△P<0.05。

2.2 p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA表達(dá) 10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h細(xì)胞p21、p53、Bax mRNA表達(dá)高于未加糙葉敗醬堿細(xì)胞，VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA表達(dá)低于未加糙葉敗醬堿細(xì)胞，P均<0.05。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度糙葉敗醬堿處理48 h時(shí)SPC-A1細(xì)胞p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與10 μmol/L比較，△P<0.05。

2.3 Caspase-3、Caspase-8活性 10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8相對(duì)活性均高于未加糙葉敗醬堿細(xì)胞(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

糙葉敗醬作為藥用植物具有豐富的生物學(xué)活性，其中糙葉敗醬總木脂素、總皂苷對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌SPC-A1細(xì)胞、 肝癌HepG2細(xì)胞和白血病K562細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用，且抑制作用與藥物濃度及作用時(shí)間相關(guān)[8,9]，但其具體作用機(jī)制尚未明確。

本研究發(fā)現(xiàn)， 糙葉敗醬堿可將肺癌SPC-A1細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且上述作用呈現(xiàn)濃度依賴性增加的趨勢(shì)。VEGF在新生血管生成中發(fā)揮重要作用，是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞新生血管生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[15]。本研究結(jié)果顯示，糙葉敗醬堿可下調(diào)VEGF表達(dá)，提示糙葉敗醬堿對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用可能與阻斷新生血管生長(zhǎng)有關(guān)。CDK1通過(guò)與cyclin形成復(fù)合物使目標(biāo)底物磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[10]；p21通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白、CDK結(jié)合為周期素依賴激酶(CDKs)復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，阻斷細(xì)胞增殖過(guò)程[11]；p53蛋白可激活p21，使其發(fā)揮細(xì)胞周期抑制作用，并修復(fù)受損的DNA，還可促進(jìn)DNA修復(fù)不成功的細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，糙葉敗醬堿可抑制CDK1表達(dá)，促進(jìn)p53和p21表達(dá)，提示調(diào)控CDK1、p21、p53表達(dá)，介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)，可能亦是糙葉敗醬堿抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。Bcl-2 基因是凋亡基因Bcl-2家族的重要成員，對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用[13]；Bax基因也是Bcl-2家族的重要成員，主要發(fā)揮促凋亡作用，亦可與Bcl-2等抗凋亡因子協(xié)同作用調(diào)控細(xì)胞的凋亡過(guò)程[14]。凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是Caspase-3激活并引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8通常以酶原的形式存在，被Caspase-3激活后可進(jìn)一步激活下游凋亡基因，發(fā)生促凋亡功能。Bcl-2是 Caspase-3的上游基因，通過(guò)抑制Caspase-3激活而發(fā)揮作用[15]。Bcl-2還是Caspase-3的直接底物，Caspase-3激活后可特異性酶解Bcl-2片段，使Bcl-2從抑制凋亡變?yōu)橛|發(fā)凋亡[16～18]。本研究10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h SPC-A1細(xì)胞Bax表達(dá)明顯高于、Bcl-2表達(dá)明顯低于未加糙葉敗醬堿細(xì)胞，進(jìn)一步活化Caspase-3和Caspase-8，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

表3 不同濃度糙葉敗醬堿處理48 h時(shí)SPC-A1細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8相對(duì)活性比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05。

綜上所述，糙葉敗醬堿可抑制肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，激活CDK1、p51、p53介導(dǎo)的凋亡途徑，調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2等基因表達(dá)，活化Caspase-3、Caspase-8可能是其作用機(jī)制。

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