干旱脅迫對冬小麥幼苗葉片光合生理特性的影響

張慶琛，鄭少萌，劉應敏，裴冬麗

（1.河南農業(yè)大學農學院，河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002；2.商丘師范學院植物與微生物互作重點實驗室，河南商丘476000；3.新疆農業(yè)大學林業(yè)研究所，新疆烏魯木齊830052）

干旱脅迫對冬小麥幼苗葉片光合生理特性的影響

張慶琛1，2，鄭少萌1，劉應敏2，3，裴冬麗2

（1.河南農業(yè)大學農學院，河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002；2.商丘師范學院植物與微生物互作重點實驗室，河南商丘476000；3.新疆農業(yè)大學林業(yè)研究所，新疆烏魯木齊830052）

為了解冬小麥幼苗葉片光合生理指標對干旱脅迫的響應，以周麥22為材料，研究了20%PEG-6000持續(xù)脅迫以及復水對小麥幼苗葉片的光合作用、光合關鍵酶和抗氧化酶活性的影響。結果表明，隨著干旱的持續(xù)，與對照組相比，干旱組小麥幼苗葉片的葉綠素（a+b），葉綠素a/葉綠素b，Rubisco活性及生物量均下降，根冠比增加；凈光合速率及PEPC，PPDK，NADP-ME，SOD，CAT，APX，POD活性均呈先升后降趨勢，最大增幅分別為18.4%（處理1 d），77.6%（處理1 d），79.2%（處理3 d），69.2%（處理1 d），155.6%（處理3 d），71.6%（處理3 d），129.4%（處理3 d），143.5%（處理1 d），復水3 d各參數(shù)均有所恢復。說明短期干旱脅迫誘導冬小麥幼苗葉片的C4途徑光合酶活性的高表達，部分補償了Rubisco活性下降對光合固碳造成的不利影響；誘導抗氧化酶活性的增加，有效增強了活性氧清除能力，減輕了氧化帶來的傷害；C4途徑光合酶可能在冬小麥耐旱生理機制中起著重要作用。

冬小麥；幼苗；干旱脅迫；氣體交換參數(shù)；光合酶；抗氧化酶

干旱是影響小麥生長發(fā)育和產量形成的重要因素之一，尤其在苗期，干旱會引起小麥分蘗不足、葉片葉綠素含量和可溶性蛋白含量下降、苗弱、根冠比增加，對中后期生長造成不可恢復的不利影響[1]。因此，在小麥幼苗期開展干旱逆境研究是其耐旱機制探討的一個重要生育時期。水分短缺會誘導小麥幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性增加，從而清除因逆境產生的活性氧的危害[2]；同時水分短缺不利于小麥幼苗葉片進行光合作用[3]，降低了干物質質量[4]。在許多C3作物葉片中除存在Rubisco外還含有一套完整的PEPC，PPDK，NADP-ME等C4途徑光合酶系統(tǒng)[5-8]，植株在正常生長條件下，C4光合酶活性較低，但在逆境條件下其活性會發(fā)生變化[9]。水稻在光氧化條件下，其葉片PEPC活性增加[10]；小麥在輕度干旱條件下，其旗葉和穗器官的C4光合酶活性增加，可以一定程度上調節(jié)逆境對光合作用的影響[11]。賈少磊等[12]分析了一天內西農1043幼苗葉片光合酶對干旱的響應，結果發(fā)現(xiàn)，C4光合關鍵酶活性增加。然而，有關長時間干旱、復水后，小麥幼苗葉片光合酶、抗氧化酶活性的動態(tài)響應以及光合酶與耐旱性關系的報道少見。

本試驗測定和分析了7 d持續(xù)干旱及復水后周麥22幼苗葉片的光合特性、光合關鍵酶和抗氧化酶的變化，旨在了解冬小麥光合生理指標對干旱的響應情況，為冬小麥耐旱育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為河南省主栽冬小麥品種周麥22，由商丘師范學院植物與微生物互作重點實驗室提供。

1.2 試驗方法

精選飽滿的種子，經10%H2O2浸泡消毒10min，用自來水沖洗數(shù)次，25℃催芽2d，待胚根長至2cm，移至Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)箱（54 cm×35 cm× 20 cm）（含自制42孔浮漂板用于載苗），每箱定苗42株，然后放入人工氣候室培養(yǎng)，每24 h更換一次營養(yǎng)液。氣候室晝/夜溫度為25℃/20℃，光周期為18 h/6 h，光強為800 μmol/（m2·s）。待幼苗生長至四葉一心時，利用添加 20%PEG-6000的Hoagland營養(yǎng)液進行處理，并設不添加PEG為對照組，每個處理10箱重復。分別于干旱脅迫0，1，3，5，7 d和復水1 d（R1），3 d（R3）測定相關指標。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 氣體交換參數(shù) 于 9：00—11：00利用Li-6400XT便攜式光合儀測定第4片完全展開且受光一致的葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）。測定時設置葉室溫度為25℃，光強為1 000 μmol/（m2·s），3次重復。

1.3.2 葉綠素含量和水分利用效率（WUE） 選取第4片葉，參照李合生[13]的方法測定葉綠素含量，參照Fischer等[14]的方法計算單葉水平上的WUE。 3次重復。WUE（μmol/mmol）＝Pn/Tr。

1.3.3 生物量 于干旱脅迫0，3，7 d和復水3 d，每個處理選取10株并分離地上部和根，105℃殺青20 min，80℃烘至恒質量測其質量，并計算根冠比。

1.3.4 光合關鍵酶（Rubisco，PEPC，PPDK和NADPME）活性 酶液提取按Ku等[15]的方法稍作改進。取0.5g葉樣液氮磨碎，加4mL預冷的提取液（50mmol/L Tirs-HCl（pH值 7.0），10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，5%PVP，10%甘油），4℃，12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶粗提液，并按照Bradford[16]的方法對可溶性蛋白濃度進行測定。光合酶測定按以下具體方法操作，6次重復。

Rubisco活性測定參照Camp等[17]的方法進行。1 mL反應體系含50 mmol/L Tricine-NaOH（pH值7.9），10 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，0.2 mmol/L NADH，5 mmol/L ATP，15 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaHCO3，5 mmol/L磷酸肌酸，2 U肌酸磷酸激酶，4 U 3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶，30℃保溫10 min，最終加入0.5 mmol/L RuBP啟動反應。并且按照如下公式計算酶活性。

Rubisco活性（μmol/（mg·h））＝（ΔA340×N）/（6.22×2×d×Δt×V×C）。其中，酶活性為每小時每毫克蛋白固定CO2的微摩爾數(shù)；ΔA340為340 nm吸光度的變化值；N為酶液稀釋倍數(shù)；6.22為每微摩爾NADH在340 nm處的吸光系數(shù)；2表示每固定1 mol CO2還原2 mol NADH；d為比色光程（cm）；Δt為ΔA340所用時間（h）；V為酶液用量（mL）；C為酶液蛋白含量（mg/mL）。

PEPC活性測定參照Ku等[15]的方法進行。1 mL反應體系含50 mmol/L Tricine-KOH（pH值8.0），0.1 mmol/L EDTA，10 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L NADH，10 mmol/L NaHCO3，1 mmol/L DTT，3 U NAD-蘋果酸脫氫酶，0.03 mL酶液，30℃保溫10 min，最終加入2 mmol/LPEP啟動反應。PEPC活性（μmol/（mg·h））計算同Rubisco。

PPDK活性測定參照Sayre等[18]的方法稍作改進。1 mL反應體系含0.1 mol/LTris-HCl（pH值8.0），10 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，1.25 mmol/L丙酮酸，50 mmol/L NaHCO3，2.5 mmol/L K2HPO4，2 U PEPC，3 U MDH，0.16 mmol/L NADH，0.03mL酶液，30℃保溫10min，最終加入1.25mmol/L ATP啟動反應。PPDK活性（μmol/（mg·h））計算同Rubisco。

NADP-ME活性參照Sayre等[18]的方法稍作改進。1 mL反應體系中含有2.5 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3），0.5 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L L-蘋果酸，0.25 mmol/LNADP，0.03 mL酶液，30℃保溫10 min，最終加入5 mmol/L MgCl2啟動反應。NADP-ME活性（U/（mg·h））以每分鐘A340減少0.01為一個酶活單位。

1.3.5 抗氧化酶（SOD，CAT，APX和POD）活性采用PBS緩沖液提取酶液，SOD活性測定參照氮藍四唑（NBT）光化學還原法進行[13]；CAT，POD活性測定按張志良等[19]的方法進行；APX活性按沈文飚等[20]的方法進行測定，分別以每分鐘A240，A470，A290變化0.01為一個酶活單位。6次重復。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel和SPSS 13.0軟件進行相關數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對小麥葉片光合特性的影響

2.1.1 對氣體交換參數(shù)的影響 由圖1可知，隨著干旱時間持續(xù)，干旱組小麥幼苗葉片的凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度均呈先升后降的趨勢，其中，脅迫1 d后，凈光合速率達到21.7 μmol/（m2·s），較對照組提高了18.4%，脅迫7d降至3.8μmol/（m2·s），較對照下降了79.3%；胞間CO2濃度則呈先降后升的趨勢；復水后干旱組的各氣體交換參數(shù)均有所恢復，但干旱組的光合速率、蒸騰速率和氣孔導度仍顯著低于對照組。說明短期干旱脅迫能夠通過增加蒸騰和氣孔調節(jié)等方式維持較高凈光合速率；長期持續(xù)干旱脅迫，會迅速誘導葉片蒸騰下降和氣孔關閉，以減少水分的散失；干旱持續(xù)7 d對小麥氣體交換參數(shù)產生了較深遠的影響。

2.1.2 對葉綠素含量和WUE的影響 植物葉片葉綠素（a+b）含量大小可反映捕獲光能能力的高低，葉綠素a/葉綠素b的值與光能轉換能力密切相關。由圖2可知，干旱組小麥幼苗葉綠素（a+b）含量和葉綠素a/葉綠素b自從水分脅迫3 d后開始均顯著低于對照組，脅迫7 d后降幅達到最大，分別下降了45.3%和24.8%；復水后葉綠素（a+b）含量和葉綠素a/葉綠素b的值有所恢復，但仍顯著低于對照組。表明持續(xù)干旱會明顯減少葉綠素含量，抑制葉片光能捕獲與轉化能力，這也與前述凈光合速率等測定結果相印證。

干旱組小麥幼苗的水分利用效率在脅迫5 d內與對照組間均無顯著差異，但是在干旱7 d降至2.1 μmol/mmol，下降了13.1%；復水后水分利用效率逐漸恢復。表明持續(xù)干旱通過影響凈光合速率間接影響著水分利用效率（圖3）。

2.1.3 對生物量的影響 從圖4可以看出，隨著干旱時間的持續(xù)，干旱組小麥幼苗的根干質量、地上部干質量較對照組均下降，復水后仍顯著低于對照組，說明持續(xù)干旱脅迫7 d對小麥地上部、根部等生物量造成了較長遠的不利影響。而根冠比隨著干旱時間的持續(xù)而增加，脅迫3，7 d均顯著高于對照組，說明冬小麥幼苗可以通過增加根冠比部分緩解水分脅迫造成的不利影響。

2.2 干旱脅迫對光合關鍵酶活性的影響

從圖5可以看出，正常水分條件下，Rubisco，PEPC，PPDK，NADP-ME光合關鍵酶活性在各個測定時刻與對照間均無明顯差異。隨脅迫時間的延長，干旱組的Rubisco呈下降趨勢，復水1 d降至最低，下降了32.0%，復水3 d后略有回升，但仍顯著低于對照組；C4途徑PEPC，PPDK，NADP-ME酶活性均呈先升后降趨勢，最大增幅分別達到了77.6%（處理1 d），79.2%（處理3 d），69.2%（處理1 d），最大降幅分別為26.2%（處理7 d），27.6%（處理7 d），30.0%（復水1 d）。PEPC/Rubsico值可反映C4途徑酶活性的相對強弱，短期干旱脅迫和復水后干旱組的PEPC/Rubsico比對照組顯著提高，干旱7 d與對照組無明顯差異（圖6）。說明短期干旱誘導C4途徑光合酶活性的增加，補償Rubsico活性下降對光合作用的不利影響，從而維持較高的凈光合速率；但是長期脅迫迅速降低了各酶活性，影響了光合固碳能力。

2.3 干旱脅迫對抗氧化酶活性的影響

從圖7可以看出，干旱組小麥幼苗葉片SOD，CAT，APX和POD活性均隨持續(xù)脅迫基本呈先升后降的趨勢，較對照組各時刻均有所增加，分別最大提高了155.6%（處理3 d），71.6%（處理3 d），129.4%（處理3 d），143.5%（處理1 d）。復水后干旱組除POD活性有所升高外，其他酶活性均接近于對照組。說明短期干旱脅迫可誘導抗氧化酶活性的增加，有利于清除活性氧對其自身的氧化傷害。

3 討論與結論

葉綠素在光能捕獲和轉換中起著重要作用，Rubisco為C3途徑的關鍵酶，在小麥等C3作物的光合固碳中起著重要作用。本研究結果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫降低了冬小麥幼苗葉片的葉綠素含量和Rubisco活性，抑制了植株生長，增加了根冠比，表明干旱脅迫影響光合作用和生物量的形成，這與前人研究結果相一致[3，12]。復水3 d內，干旱組的葉綠素含量、Rubisco活性、根干質量、地上部干質量等指標有所恢復，但仍顯著低于對照組，說明持續(xù)干旱7 d對小麥光合、生物量造成了較深遠的不利影響，這為從事小麥干旱逆境研究工作提供了一定借鑒。

PEPC，PPDK，NADP-ME等為C4途徑的關鍵酶，在小麥中其活性存在差異[7]，PEPC具有固定大氣CO2和再固定C3作物呼吸釋放CO2的作用[21]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，冬小麥幼苗葉片的PEPC，PPDK，NADP-ME等C4光合酶變化隨持續(xù)干旱呈先升后降的趨勢，與凈光合速率的變化趨勢相似，表明短期干旱誘導C4光合酶活性高表達，部分補償了因Rubisco活性下降對光合固碳造成的不利影響，這可能是冬小麥在水分脅迫下仍保持較高的凈光合速率的重要原因。然而，長期干旱脅迫使得C3，C4光合酶活性，葉綠素（a+b）含量和葉綠素/葉綠素b的值下降，超出冬小麥葉片生理基礎，導致其凈光合速率急劇下降。

干旱等逆境將打破植物體內活性氧產生與清除的動態(tài)平衡關系，導致活性氧在體內大量積累?？寡趸到y(tǒng)的酶類主要有SOD，CAT，APX和POD等，在干旱脅迫下植株酶活性增加有效增強活性氧清除能力，減輕氧化傷害，以實現(xiàn)構建新的動態(tài)平衡的目的[22]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，隨著干旱的持續(xù)，冬小麥幼苗葉片SOD，CAT，APX和POD抗氧化酶活性變化呈先升后降趨勢，表明短期脅迫誘導抗氧化酶活性增加，用以維系新的動態(tài)平衡，但隨脅迫的持續(xù)活性氧的積累超出抗氧化酶清除能力，其活性反被抑制呈現(xiàn)下降。復水后干旱組SOD，CAT，APX活性恢復接近于對照組的值，而POD活性仍有所升高，可能是由POD雙重性作用引起的，即POD一方面可清除H2O2，表現(xiàn)為保護效應；一方面在逆境后期參與葉綠素的降解、活性氧的生成，表現(xiàn)為傷害效應[22]。

抗氧化酶系統(tǒng)能夠積極響應干旱脅迫，此系統(tǒng)清除活性氧的過程被認為是作物耐旱機制的一個重要方面。然而，耐旱機制是一個復雜的過程，已有研究表明，C3途徑關鍵酶Rubisco在小麥中可作為一個耐旱的代謝指標[23]。本試驗還發(fā)現(xiàn)，C4光合關鍵酶（PEPC，PPDK，NADP-ME）活性也能夠積極響應干旱脅迫，故推測C4光合關鍵酶可能在冬小麥耐旱生理機制中起著重要作用。

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Effects of Drought Stress on Photosynthetic Physiology Characteristics in Winter Wheat Seedling Leaves

ZHANGQingchen1，2，ZHENGShaomeng1，LIUYingmin2，3，PEI Dongli2
（1.College ofAgronomy，Henan Agricultural University，Collaborative Innovation Center ofHenan Grain Crops，Zhengzhou 450002，China；2.KeyLaboratoryofPlant-Microbe Interactions，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China；3.Institute ofForestry，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

To understand the effects of drought stress on photosynthetic physiology parameters of winter wheat seedling leaves,this paper took Zhoumai 22 as material,and analyzed the effect of20%PEG-6000 last for 7 days and re-water to the photosynthesis,the key photosynthetic enzymes and antioxidase activities of winter wheat seedling leaves.The result showed that as drought stress continuing, compared with the control,the Chl（a+b）,Chla/Chlb,Rubisco activity and biomass all declined of wheat seedling leaves in the drought group,while the radio of root to shoot dry weight increased.Net photosynthetic rate and the enzymes activities in the leaves all showed a rise first followed by a decline.The maximum increase of net photosynthetic rate was 18.4%in one day after drought treatment,the activities ofPEPC,PPDK,NADP-ME,SOD,CAT,APXand PODwas 77.6%（1 d），79.2%（3 d），69.2%（1 d），155.6%（3 d），71.6%（3 d），129.4%（3 d），143.5%（1 d）,respectively.All of the parameters were restored in 3 days after re-water.These results indicated that short-term drought stress could enhance the activity of C4pathway photosynthetic enzymes and it could partial offset the negative influence to photosynthetic carbon fixation with the decreasing of the Rubisco activity.It could increase the activity of antioxidases.The abilityin clearingup active oxygen were effectivelyenhanced and could use it to reduce the harm ofoxidation.C4pathway enzymes might playan important role in physiological mechanismofdrought-resistant ofwinter wheat seedlings.

winter wheat;seedling;drought stress;gas-exchange parameters;photosynthetic enzymes;antioxidant enzymes

S512.1＋1

A

1002-2481（2016）08-1077-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.08.06

2016-04-29

國家自然科學基金項目（31571997）

張慶?。?981-），男，河南夏邑人，講師，碩士，主要從事小麥分子育種研究工作。裴冬麗為通信作者。