獺兔玉米赤霉烯酮中毒的診斷

劉吉山,肖躍強(qiáng)，唐世云，謝金文，姚春陽，莫 玲，黃 兵

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所， 山東濟(jì)南 250023)

獺兔玉米赤霉烯酮中毒的診斷

劉吉山1*,肖躍強(qiáng)1，唐世云1，謝金文1，姚春陽1，莫 玲1，黃 兵2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所， 山東濟(jì)南 250023)

山東某獺兔場飼養(yǎng)的3 000只母兔發(fā)生了一種以流產(chǎn)及青年兔死亡為特征的疾病，通過對發(fā)病兔進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及兔病毒性出血癥病毒的RT-PCR以及飼料中的玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素及黃曲霉毒素進(jìn)行鑒別檢測，首先排除細(xì)菌病及兔病毒性出血癥發(fā)病的可能，并從飼料中檢測3種毒素的含量分別為1 196.1、130.8、6 μg/kg，經(jīng)過對照飼料標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮嚴(yán)重超出標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)為300 μg/kg)。通過飼喂試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這次發(fā)病與所飼喂的飼料有關(guān)，診斷為玉米赤霉烯酮中毒。

獺兔；玉米赤霉烯酮；中毒；診斷

在家兔飼料或飼料原料中生長的霉菌主要有3種，即曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌。玉米赤霉烯酮(ZEA)是一種特殊毒性的生物毒素具有類雌激素作用，它除了對繁殖機(jī)能造成影響外，還具有肝毒性、免疫毒性、細(xì)胞毒性和遺傳毒性，且對腫瘤的發(fā)生也有一定影響[1-2]。低濃度水平的ZEA會(huì)引起青春期前動(dòng)物的外陰道炎，連續(xù)飼喂高濃度的ZEA使動(dòng)物產(chǎn)生持續(xù)動(dòng)情期、假孕和不孕的現(xiàn)象[3]，能引起家兔雌激素功能亢進(jìn)的效應(yīng)，如陰道脫垂、陰門腫大、乳腺腫脹，也能夠引起家兔流產(chǎn)、死胎、癱瘓、腸炎、便秘、青年兔死亡等，并損傷家兔免疫機(jī)能，導(dǎo)致多種疫苗免疫失敗，從而引發(fā)兔場疫病流行[4]。

本文報(bào)道的是飼料中ZEA超標(biāo)引發(fā)的青年兔、母兔拒食，隨后青年兔死亡，近50%母兔出現(xiàn)流產(chǎn)的病例。該兔場飼養(yǎng)母兔3 000余只，在更換不同品牌兔飼料后12 d，大群兔陸續(xù)出現(xiàn)采食減少的現(xiàn)象，3 d后青年兔完全拒食，兔體重越大情況越嚴(yán)重，日死亡20余只;母兔出現(xiàn)流產(chǎn)、拒食，至我處診斷時(shí)已20%左右有流產(chǎn)，隨著病情發(fā)展，流產(chǎn)率達(dá)到50%，近500只母兔流產(chǎn)。剖檢死亡兔可見肝臟呈黃色，布滿大小不一的黃白色壞死灶及壞死區(qū)域、肝硬化、腹水，腎臟出血、壞死。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 被檢樣品

1.1.1.1 病料 無菌采集死亡獺兔的肝臟、脾臟、肺臟及腎臟，置于2℃～8℃冰箱備用。

1.1.1.2 飼料樣品 采集發(fā)病兔場飼喂的飼料，置于塑料袋內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁肉湯，山東雨林生物制品有限公司產(chǎn)品，配制按說明書進(jìn)行，滅菌后加入10 mL/L裂解血和40 mL/L雞血清；馬丁血清裂解血平板，在以上基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂粉，滅菌，傾倒平板即可[5]。明膠、MR等生理生化培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制[6]。

1.1.3 兔病毒性出血癥病毒引物 根據(jù)謝金文等[7]報(bào)道的兔病毒性出血癥病毒基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件輔助各設(shè)計(jì)一對引物。引物由上海生物生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列為：RHDV1:5′-CGTGCTGAGCCAGATGTA-3′,RHDV2:5′-GGTTGCAGTCCCACTATTT-3′，理論擴(kuò)增片段長486 bp。

1.1.4 霉菌毒素檢測試劑 ZEA ELISA檢測試劑盒、黃曲霉毒素ELISA檢測試劑盒、嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒，山綠都生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6只體重1.2 kg清潔級健康獺兔，山東綠都科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀與剖檢病變 首先了解發(fā)病兔臨床癥狀，并剖檢發(fā)病兔，觀察臟器組織的病理學(xué)變化。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 無菌采取病死兔肝臟、脾臟、腎臟、肺臟，無菌操作分別涂布接種2個(gè)鮮血瓊脂平板，其中1組大氣環(huán)境，37 ℃培養(yǎng)48 h。另一組厭氧，37℃培養(yǎng)48 h，觀察有無細(xì)菌菌落生長[6]。

1.2.3 兔病毒性出血癥病毒RT-PCR檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。無菌取病兔的肝和脾等組織進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融3次，離心后取上清，經(jīng)RNA提取→反轉(zhuǎn)錄合成cDNA→PCR擴(kuò)增→10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測流程，判定是否為RHDV感染所致。

1.2.4 飼料中霉菌毒素檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行。

1.2.4.1 毒素提取 稱取粉碎樣品1.0 g ± 0.05 g至離心管中，加入 10 mL 樣品提取液震蕩，離心，取上清液稀釋100倍。

1.2.4.2 反應(yīng) 取稀釋后的上清液50 μL，加到對應(yīng)的微孔中，加入ZEA酶標(biāo)物50 μL/孔， 再加入ZEA抗體50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)20 min。

1.2.4.3 洗板 按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.4.4 顯色 分別加入底物液A液、B液各50 μL/孔，振蕩混勻，置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)10 min。

1.2.4.5 測定 加入終止液50 μL/孔，用酶標(biāo)儀立即測定450 nm處的吸光度值。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中ZEA實(shí)際濃度[8-9]。同時(shí)按照試劑盒的說明書(檢測方法同ZEA)對飼料中的黃曲霉毒素和嘔吐毒素進(jìn)行檢測，并根據(jù)相應(yīng)的分析軟件進(jìn)行分析得出相應(yīng)的毒素含量。

1.2.5 動(dòng)物試驗(yàn) 將獺兔分為2組，試驗(yàn)組4只，對照組2只，在同一間舍內(nèi)飼喂，試驗(yàn)組飼喂發(fā)病場內(nèi)的飼料，對照組飼喂其他品牌飼料，連續(xù)飼喂21 d，觀察結(jié)果。

1.2.6 治療 全群立即停止飼喂該品牌該批飼料，逐步加入另一批次飼料，并且全群飲水中加入50 g/L葡萄糖和1 g/L維生素C，連續(xù)應(yīng)用3 d。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀與剖檢病變

臨床癥狀主要表現(xiàn)為青年兔、母兔拒食，隨后青年兔死亡，近50%母兔出現(xiàn)流產(chǎn)的病例。日死亡20余只，兔體重越大情況越嚴(yán)重；剖檢死亡兔可見，肝臟呈黃色、布滿大小不一的黃白色壞死灶，肝硬化、腹水，腹腔纖維素性滲出(圖1)；腎臟出血、壞死(圖2)。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)

無論在正常還是厭氧環(huán)境均無細(xì)菌菌落生長，涂片、鏡檢未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。

2.3 兔病毒性出血癥病毒RT-PCR檢測結(jié)果

陽性對照擴(kuò)增出486 bp大小的特異性條帶，而組織樣品上清液與陰性對照均未擴(kuò)增出486 bp大小的特異性條帶(圖3)，判為陰性。

圖1 肝臟剖檢病變

圖2 腎臟剖檢病變

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.樣品PCR產(chǎn)物；2.陽性對照；3.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products of sample;2.Positive control;3.Negtive control

圖3 RHDV RT-PCR鑒定結(jié)果

Fig.3 Identification result of RHDV by RT-PCR

2.4 飼料霉菌毒素檢測結(jié)果

檢測結(jié)果見表1。由檢測得知飼料中ZEA含量達(dá)到1 196.1 μg/kg，其上限為300 μg/kg，屬于嚴(yán)重超標(biāo)范疇，此次發(fā)病應(yīng)與此有關(guān)。

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)飼喂至9 d，試驗(yàn)組開始出現(xiàn)剩料，至13 d剩料逐漸增多，15 d后拒食，精神不振，死亡2只，剖檢后與臨床發(fā)病相似，剩余2只剖檢后，出現(xiàn)了肝臟壞死病變。對照組2只連續(xù)飼喂至21 d無臨床變化。由此得知該兔場發(fā)病與所喂飼料相關(guān)。

2.6 治療

經(jīng)更換飼料，并且使用50 g/L葡萄糖和1 g/L維生素C，大群于24 h后逐步恢復(fù)飲食，48 h停止流產(chǎn)。

表1 被檢飼料中毒素含量

Table 1 The contents of zearalenone,vomitoxin and aflatoxin in detected feed samples

毒素Toxin含量/(μg·kg-1)Content參考標(biāo)準(zhǔn)/(μg·kg-1)Referencestandard是否超標(biāo)Overstandard黃曲霉毒素Aflatoxin60～50否No嘔吐毒素Vomitoxin130.80～1000否No玉米赤霉烯酮Zearalenone1196.10～300是Yes

3 討論

從動(dòng)物發(fā)病與臨床剖檢病變，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷，采用RT-PCR與有氧、厭氧細(xì)菌分離培養(yǎng)分別排除了發(fā)病癥狀類似的兔病毒性出血癥、兔巴氏桿菌病等微生物感染所引的發(fā)病。經(jīng)動(dòng)物飼喂試驗(yàn)，當(dāng)健康家兔飼喂該種類飼料至第9天時(shí)，試驗(yàn)兔出現(xiàn)了明顯不適，15 d時(shí)出現(xiàn)死亡，并且拒食，而飼喂其他種類的飼料未出現(xiàn)臨床癥狀，表明該種類飼料與家兔發(fā)病直接相關(guān)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，飼料中黃曲霉毒素、嘔吐毒素含量低于國家最高標(biāo)準(zhǔn)，而ZEA達(dá)到1 196.1 μg/kg，屬于嚴(yán)重超標(biāo)范疇，臨床癥狀亦符合該毒素中毒的臨床癥狀，即家兔流產(chǎn)、死胎、癱瘓、腸炎、便秘、青年兔死亡等。剖檢變化亦符合該毒素中毒的癥狀，即肝臟壞死、腎臟出血、壞死、腹水等。因此從多方面來判定，該兔場發(fā)病為飼料中ZEA含量高，導(dǎo)致飼養(yǎng)兔中毒。

ZEA是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于飼料及飼料原料中。作為一種內(nèi)酯類化合物，它具有類雌激素作用，能夠產(chǎn)生肝毒性、免疫毒性、細(xì)胞毒性和遺傳毒性，給養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成了極大的危害。合理的存儲(chǔ)方式可以減輕ZEA產(chǎn)生的機(jī)率。飼料中霉菌毒素一直是影響動(dòng)物健康的主要因素之一，特別是對于家兔飼料，不僅玉米中霉菌毒素含量高[10-11]，而且花生蔓、地瓜秧等優(yōu)質(zhì)粗纖維飼料，在田間生長期就有部分霉變，把它作為飼料原料儲(chǔ)存，如果貯存不當(dāng)，極有可能出現(xiàn)霉菌二次生長從而產(chǎn)生大量霉菌毒素，使其含量大大超標(biāo)，從而引發(fā)家兔霉菌毒素中毒。

ZEA中毒的治療，一般無特效解毒藥，只能先停止飼喂可疑飼料，采取非特異性一般治療措施，即飲用葡萄糖水及維生素C等，以緩解其臨床癥狀，增加肝臟的解毒能力，促進(jìn)排泄，從而減輕癥狀，在本次治療過程中，采取葡萄糖水及維生素C的治療方法效果良好。目前，對于飼料中的霉菌毒素的脫毒，主要是兩種方式，一是物理吸附法，即以蒙脫石為代表的霉菌吸附劑，二是生物酶去除法[12]。前者吸附作用特異性差，長期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物營養(yǎng)缺乏，后者特異性強(qiáng)，因此每種毒素都需要一種解毒物質(zhì)，并且需要在體內(nèi)反應(yīng)時(shí)間太長，因此，目前對于飼料中霉菌毒素的去除還沒有有效成熟的解決方式，在臨床實(shí)踐中只要懷疑該病就要首先停喂該批次飼料，然后再采取對癥治療的措施，緩解兔體反應(yīng)。

目前，我國在家禽、牛及豬飼料中霉菌毒素的含量都有明確的規(guī)定，但在家兔飼料中尚未有明確規(guī)定。本次報(bào)告中飼料中霉菌毒素的最高標(biāo)準(zhǔn)參考了家禽和豬飼料的國家標(biāo)準(zhǔn)，通過檢測發(fā)現(xiàn)ZEA達(dá)到了1 196.1 μg/kg，國標(biāo)上限為小于300 μg/kg。霉菌毒素對于家禽、豬等動(dòng)物的影響，在各種學(xué)術(shù)期刊中都有很多的報(bào)道，對于家兔的報(bào)道卻很少，鮮有提及，家兔作為草食性動(dòng)物，各種植物中都存在發(fā)霉的情況[10，13]，特別是秸稈類飼料，極有可能在田間污染，因此，作為飼料生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中要格外謹(jǐn)慎，防止霉菌毒素對家兔帶來傷害，從而引發(fā)與養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)糾紛。

[1] 何學(xué)軍，齊德生.玉米赤霉烯酮的毒性研究進(jìn)展[J].中國飼料，2006(10)：2-5.

[2] 鄧友田，袁 慧.玉米赤霉烯酮毒性機(jī)理研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28(2):89-92.

[3] 趙建華，鄒 楊，姜淑貞.玉米赤霉烯酮毒害作用研究進(jìn)展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2008(8)：45-47.

[4] 劉吉山，王玉茂，張松林.兔場流行病防控技術(shù)[M].北京：金盾出版社，2013：134-140.

[5] 陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994：237.

[6] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：248-252.

[7] 謝金文，李 峰，王金良，等.兔病毒性出血癥分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013(11)：28-29.

[8] 鄧舜洲，何慶華，章 英，等.競爭間接ELISA檢測飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(2)：289-292.

[9] 王景琳，張志東.競爭間接ELISA檢測谷物飼料中的玉米赤霉烯酮[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1994，14(12)：154-157.

[10] 李榮濤，謝 剛，付鵬程，等.小麥和玉米中玉米赤霉烯酮污染情況初探[J].糧食儲(chǔ)藏，2004，32(5)：36-38.

[11] 姜淑貞，楊維仁，楊在賓.玉米赤霉烯酮的代謝、毒性及其預(yù)防措施[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2011，23(2)：196-202.

[12] Vrabcheva T,Gessler R,Usleber E,et al.First survey on the natural occurrence ofFusariummycotoxins in Bulgarian wheat [J].Mycopathologia,1996,136(1):47-52.

[13] Paster N,Blumenthal-Yonassi J,Barkai-Golan R,et al.Production of zearalenoneinvitroand in corn grains stored under modified atmospheres [J].Int J Food Microbiol,1991,12(2-3):157-165.

Diagnosis of Zearalenone Intoxication in Rex Rabbits

LIU Ji-shan1,XIAO Yue-qiang1,TANG Shi-yun1,XIE Jin-wen1,YAO Chun-yang1,MO Ling1,HUANG Bing2

(1.BinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong,256600,China; 2.Poultryinstitute,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong,250023,China)

A disease，which is characterized by abortion in 3 000 female rabbits and death of yong rabbits,emerged in a warren in Shandong province.The detections of zearalenone,vomitoxin and aflatoxin in feed were performed.The results showed that the contents of zearalenone,vomitoxin and aflatoxin were 1 196.1 μg/kg, 130.8 μg/kg and 6 μg/kg,respectively,and the content of zearalenone was much higher than that of the feed standard (300 μg/kg).The feeding test showed a correlation between the disease and the feed with higher zearalenone level.Furthermore,the bacterial culture and RT-PCR of rabbit viral hemorrhagic disease virus (RHDV) for differential diagnoses were also performed, and the possibility of bacteriosis and RHD were excluded. It was concluded that the disease was caused by zearalenone intoxication.

rex rabbit; zearalenone; intoxication; differential diagnosis

2015-10-19

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(SDAIT-18-001-06)

劉吉山(1975-)，男，山東高唐人，副研究員，碩士，主要從事生物制品學(xué)與獸醫(yī)臨床研究。*通訊作者

S858.291;S859.81

B

1007-5038(2016)05-0129-04