豬流行性腹瀉病毒云南流行毒株N基因序列分析

宋 聰，劉 寧 ，李美荃，石於友，李華春，高 林 ，楊榮麗 ，姚 俊*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明 650201 ；2.云南省巍山縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，云南巍山 672400； 3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224)

豬流行性腹瀉病毒云南流行毒株N基因序列分析

宋 聰1，劉 寧1，李美荃1，石於友2，李華春3，高 林3，楊榮麗3，姚 俊3*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明 650201 ；2.云南省巍山縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，云南巍山 672400； 3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224)

為了解近年來(lái)云南省PEDV流行毒株的變異情況，選取了采集自昆明西翥、富源、廠口、 玉溪紅塔等地方豬場(chǎng)的不同時(shí)間的6份PEDV陽(yáng)性水樣腹瀉糞便樣品，進(jìn)行N基因的RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析。結(jié)果表明，來(lái)自同一豬場(chǎng)不同流行時(shí)間的TY1、TY2、TY3毒株之間，TY1與TY2毒株N基因核苷酸序列完全相同，僅TY3毒株在第80和第1 238位置處的堿基發(fā)生了變異(A→C、C→T)，TY3與TY1、TY2的毒株N基因核苷酸序列的同源性達(dá)99.8%。云南6個(gè)流行毒株TY1、TY2、TY3、YXHT、FYDH及Changkou的核苷酸序列的同源性為99.2%～100%。云南6個(gè)流行毒株與2014年德國(guó)毒株GER-L00721-2014(Accession: LM645057.1)、法國(guó)毒株KR011756-FR001-2014(Accession: KR011756.1)及我國(guó)2010年河北毒株JF700126.1-HB-HS-2010(Accession: LM645057.1)的核苷酸序列同源性為98.6%～100%，并同屬于一個(gè)進(jìn)化分支。云南6個(gè)流行毒株與CV777經(jīng)典疫苗毒株之間的同源性?xún)H為95.2%～95.5%，存在一定的變異，這或許是云南省豬群經(jīng)PEDV疫苗免疫后保護(hù)率較低的原因之一。

豬流行性腹瀉病毒；N基因；序列分析；云南株

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬成員(Coronavirus)之一，在糞便病料中所見(jiàn)的病毒粒子是多形態(tài)的，大致呈球形，其平均直徑(包括纖突)約130 nm，范圍在95 nm～190 nm之間[1]。PEDV基因組全長(zhǎng)約為28 kb，為線性單鏈正股RNA[1-2]。豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，位于病毒內(nèi)部的基因組轉(zhuǎn)錄成亞基因組基因后可以編碼幾種結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性蛋白，其中主要的蛋白包括小膜蛋白(E蛋白，大小為7 ku)、膜蛋白(M蛋白,大小約20 ku～30 ku)、纖突糖蛋白(S蛋白,大小約150 ku～220 ku)、核衣殼蛋白(N蛋白,大小為58 ku)，其中，PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大的為N基因所編碼的N蛋白，保守性很強(qiáng)且能在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)[3]。另外，除以上主要的蛋白外，豬流行性腹瀉病毒內(nèi)部的基因組5′端還具有1a和1b兩大開(kāi)放閱讀框(ORFs),分別編碼pp1a和pp1b這兩種非結(jié)構(gòu)性蛋白，且可以直接進(jìn)行基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[2]。其3′端則是非翻譯區(qū)，末端鏈接Poly(A)序列[4]。其中間則是包括6個(gè)開(kāi)放閱讀框，自5′-3′端依次是編碼酶多聚蛋白、S蛋白、ORF3蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的基因[4-5]。

由PEDV所引發(fā)的疾病稱(chēng)為豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)，病毒主要是通過(guò)破壞各年齡段豬腸道上皮絨毛細(xì)胞而使豬出現(xiàn)嘔吐、脫水、腹瀉等病理癥狀，其中尤以哺乳仔豬最易感染[6]。相較于夏季而言，每年的10月底至第2年的2月是流行性腹瀉病的傳染高發(fā)期，此病傳染率高、發(fā)病力強(qiáng)、流行性廣，可以給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失并制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，是流行于世界范圍內(nèi)的傳染性豬病之一[7]。

早在1971年，英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了豬流行性腹瀉[8]。1978年，比利時(shí)和英國(guó)首次分離到此種病毒并將其命名為豬流行性腹瀉病毒(CV777)，屬冠狀病毒科[1]。自那時(shí)起，豬流性腹瀉多暴發(fā)于歐洲。20世紀(jì)80年代至90年代，豬流行性腹瀉病相繼在中國(guó)、韓國(guó)、日本等亞洲國(guó)家發(fā)現(xiàn)存在并開(kāi)始大范圍暴發(fā)，其導(dǎo)致的仔豬(小于1周齡)死亡率高達(dá)30%～80%[9-11]。直到現(xiàn)在，豬流性腹瀉仍在亞洲地區(qū)橫行，時(shí)有暴發(fā)，對(duì)亞洲養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一直以來(lái)，美洲都未見(jiàn)有關(guān)于豬流行性腹瀉病的報(bào)告，直到2013年5月，美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)豬流行性腹瀉病毒的感染，并在2013年-2014年間迅速蔓延至美國(guó)的33個(gè)州，甚至古巴、加拿大、墨西哥、哥倫比亞、秘魯?shù)绕渌乐迖?guó)家也相繼報(bào)道了豬流行性腹瀉病疫情[12-12]。截止到2014年底，全球已經(jīng)有超過(guò)30個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)有豬流行性腹瀉病毒的存在[9-14]。特別是自2010年以來(lái)，豬流行性腹瀉在我國(guó)全國(guó)范圍再次肆掠，導(dǎo)致大批哺乳仔豬的死亡，有的豬場(chǎng)死亡率甚至高達(dá)100%，給我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成毀滅性的打擊，即使通過(guò)給妊娠母豬接種滅活疫苗或者弱毒活疫苗，預(yù)防效果均不理想，大部分豬場(chǎng)通過(guò)給妊娠母豬返飼本場(chǎng)發(fā)病哺乳仔豬糞便或腸內(nèi)容物后起到較好的預(yù)防效果。2010年底以前，PEDV的流行相對(duì)弱一些，且僅僅為散發(fā)，但2011年以來(lái)，包括臺(tái)灣省在內(nèi)的很多國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)了PEDV的變異毒株，新生的哺乳仔豬呈現(xiàn)出嚴(yán)重的水樣腹瀉及更高的死亡率[15-16]。

近年來(lái)云南省生豬養(yǎng)殖業(yè)不斷遭受到豬流行性腹瀉暴發(fā)流行的沉重打擊，大多數(shù)規(guī)?；i場(chǎng)哺乳仔豬死亡率高達(dá)100%，給生豬養(yǎng)殖企業(yè)及養(yǎng)殖散戶(hù)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬群妊娠母豬即使經(jīng)過(guò)國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口滅活疫苗、弱毒活疫苗產(chǎn)品免疫預(yù)防，但均以失敗告終，反而大大提高了豬場(chǎng)的疫苗成本。部分豬場(chǎng)通過(guò)給妊娠母豬返飼本場(chǎng)早期發(fā)病哺乳仔豬小腸內(nèi)容物及糞便病料后，均取得立竿見(jiàn)影的預(yù)防效果，雖然預(yù)防效果較好，但此種原始的免疫方法存在散毒，以及傳播偽狂犬等其他疫病的風(fēng)險(xiǎn)。使用本場(chǎng)PEDV病料返飼妊娠母豬預(yù)防PEDV效果理想的事實(shí)，足以證明當(dāng)前使用的基于CV777來(lái)源的疫苗毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體不能完全中和近年來(lái)的PEDV流行毒株，許多國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的研究結(jié)果也提示當(dāng)前的流行毒株與歷史毒株及CV777疫苗毒株比較均出現(xiàn)了較大的變異，因此，非常有必要弄清云南省當(dāng)前PEDV流行毒株的變異情況，明確其近年來(lái)的PEDV流行毒株與國(guó)內(nèi)外歷史毒株及最近幾年引起全球暴發(fā)流行的變異毒株之間的遺傳學(xué)關(guān)系，為云南省豬流行性腹瀉的防控及將來(lái)新型疫苗、特異性治療及預(yù)防用生物制品的研發(fā)，以及抗PEDV轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。為此，本文對(duì)近年來(lái)暴發(fā)流行于云南省的豬流行性腹瀉進(jìn)行了檢測(cè)，并選取了相對(duì)保守的N基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序及序列分析，弄清了云南省PEDV流行毒株與歷史毒株及國(guó)內(nèi)外變異毒株的遺傳學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2013年7月至2015年4月采集自不同地理位置的云南省6家大規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)水樣腹瀉癥狀的哺乳仔豬腸系膜淋巴結(jié)或糞便樣品9份，經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)鑒定，選出6份豬流行性腹瀉病毒呈陽(yáng)性的糞便樣品作為N基因測(cè)序樣品(表1)。

1.1.2 主要試劑和儀器 病毒RNA提取試劑盒(Viral RNA Kit)，美國(guó)OMEGA生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker 2000，天根生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR試劑盒(Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PCR 儀 Gene Amp PCR system 9700、梯度PCR儀， ABI(Applied Biosystems Inc.)公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 根據(jù)經(jīng)典毒株CV777基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物能夠擴(kuò)增N基因全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增全長(zhǎng)為1 697 bp，由昆明碩擎生物有限公司合成后，加ddH2O稀釋至10 μmol/L(表2)。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取 將6份樣品按照質(zhì)量體積比1∶5的比例加入1×MEM后勻漿后，4℃條件下3 000 r/min離心5 min，取上清，按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒RNA提取，將提取的RNA存儲(chǔ)于-80℃冰箱，備用。

1.2.2 豬流行性腹瀉病毒N基因的PCR擴(kuò)增 RT-PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下：25×Prime script one step enzyme 1 μL，2×One step buffer 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，陽(yáng)性對(duì)照及樣品RNA 3 μL，ddH2O 6.5 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃ 30 min；95℃ 2 min；95℃ 1 min；52℃ 1 min，72℃ 2 min 10 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 目的基因片段的切膠回收、純化、測(cè)序及序列分析 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、純化后，送昆明碩擎生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列登錄NCBI GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 PEDV N基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用上、下游引物和RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出6株P(guān)EDV云南流行毒株的N基因片段，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，目的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，大小約為1 700 bp左右(圖1)。

表1 樣品來(lái)源信息

Table 1 The information of sample sources

樣品采集地點(diǎn)Samplelocation樣品數(shù)量Samplenumbers毒株Strains測(cè)序基因Sequencinggene送檢時(shí)間Time西翥Xizhu3TY1/TY2/TY3N2014.1/2014.4/2015.3富源Fuyuan1FYDHN2014.4廠口Changkou1ChangkouN2013.7玉溪紅塔Yuxihongta1YXHTN2015.4

表2 PCR 引物

Table 2 PCR primers

引物Primers序列(5'-3')Sequence(5'-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpLength最適退火溫度/℃Optimumannealingtemperature上游引物(F)Upstreamprimer5'-TTCGGTTCTCACAGATAGT-3'169746.7下游引物(R)Downstreamprimer5'-CCGTCAGGTCTTCAGTTA-3'47.7

1.空白；2.陰性對(duì)照；3.陽(yáng)性對(duì)照；4.樣品；M. DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000

1.Black;2. Negative control; 3. Positive control; 4. Sample;M. DNA Marker DL 2 000

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 The results of RT-PCR

2.2 PEDV N基因 序列分析

利用DNA Star分析軟件對(duì)測(cè)定出的核苷酸序列進(jìn)行拼接、校對(duì)，獲得6株P(guān)EDV云南流行毒株完整的N基因片段(大小為1 326 bp)，并與NCBI GenBank中國(guó)內(nèi)外一些經(jīng)典參考毒株進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，來(lái)自于同一地方不同時(shí)間的TY1、TY2、TY3毒株之間，TY1與TY2毒株核苷酸序列完全相同，僅TY3毒株在第80和第1 238位置處的堿基發(fā)生了變異(A→C、C→T)，TY3與TY1、TY2的同源性達(dá)99.8%。云南6個(gè)流行毒株TY1、TY2、TY3、YXHT、FYDH及Changkou的同源性介于99.2%～100%， 云南6個(gè)流行毒株與2014年德國(guó)毒株(GER-L00721-2014)、法國(guó)毒株(KR011756-FR001-2014)及我國(guó)2010河北毒株(JF700126.1-HB-HS-2010)介于98.6%～100%。云南6個(gè)流行毒株與CV777經(jīng)典疫苗毒株之間的同源性?xún)H僅介于95.2%～95.5%，存在一定的變異。云南6個(gè)流行毒株與2014年德國(guó)毒株GER-L00721-2014(GenBank: LM645057.1)、法國(guó)毒株KR011756-FR001-2014(GenBank: KR011756.1)及國(guó)內(nèi)河北毒株JF700126.1-HB-HS-2010(GenBank: LM645057.1)同屬于一個(gè)進(jìn)化分支(圖2)。

3 討論

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)相似，基因組全長(zhǎng)約為28kb,為線性單鏈正股RNA[5-6]，該病毒的傳播和流行使國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)蒙受了巨大的損失。2013年，美洲各大豬場(chǎng)流行性腹瀉的發(fā)現(xiàn)與感染，使得PED的傳播范圍擴(kuò)大，變異毒株增多[7-8]。針對(duì)目前關(guān)于云南PEDV地方流行毒株的變異性研究幾乎為空白，所以本研究采集不同地理位置不同流行時(shí)期的云南規(guī)?；i場(chǎng)PEDV流行毒株，進(jìn)行N基因全基因片段的測(cè)序和序列分析，以期找出與國(guó)內(nèi)外流行毒株及經(jīng)典疫苗毒株CV777的異同，為進(jìn)一步研究PEDV云南地方流行毒株的病原性及變異性提供參考依據(jù)。PEDV的N蛋白在病毒感染宿主后進(jìn)行自我復(fù)制時(shí)發(fā)揮重要作用，編碼病毒的核衣殼蛋白[9]。由于N蛋白具有抗原性，所以在PEDV感染早期就能在豬體內(nèi)產(chǎn)生較高水平的抗體并誘導(dǎo)病豬體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。因此N蛋白可以作為一個(gè)重要指標(biāo)來(lái)快速有效的進(jìn)行檢測(cè)PEDV的感染狀況。本試驗(yàn)采用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增了6份PED云南流行毒株的N基因，測(cè)序分析結(jié)果表明，云南6個(gè)流行毒株TY1、TY2、TY3、YXHT、FYDH及Changkou的同源性介于99.2%～100%，變異較小。與經(jīng)典毒株CV777相比，云南6個(gè)流行毒株與CV777經(jīng)典疫苗毒株之間的同源性?xún)H僅95.2%～95.5%，存在一定的變異，這或許是疫苗免疫后豬群無(wú)法獲得較為理想保護(hù)率的原因。云南6個(gè)流行毒株與2014年德國(guó)毒株(GER-L00721-2014)、2014法國(guó)毒株(KR011756-FR001-2014)及我國(guó)2010河北毒株(JF700126.1-HB-HS-2010)介于98.6%～100%，同源性較高，且同處于一個(gè)進(jìn)化分支。歐洲與中國(guó)在地里位置上相距遙遠(yuǎn)，然而德國(guó)及法國(guó)2014毒株N基因與我國(guó)云南流行毒株及我國(guó)河北毒株(2010)同源性較其他毒株要高，其中的原因有待進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究中的6份PEDV云南流行毒株N基因序列與CV777經(jīng)典毒株之間存在一定的差異，這可能是云南地區(qū)PEDV致病力增強(qiáng)且豬群經(jīng)PEDV疫苗免疫后保護(hù)率較低的重要原因之一。PEDV在云南省的豬群感染和發(fā)病必須引起業(yè)內(nèi)人士的高度重視，其內(nèi)在原因和機(jī)理需進(jìn)一步的研究和探索。

圖2 基于PEDV N基因核苷酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

Fig.2 Phylogenetic tree based on N gene nucleotide sequence of PEDV

[1] Pensaert M B, de Bouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol,1978，58(3):243-247.

[2] Anastasia N, Douglas M. Distinct characteristcs and complex evolution of PEDV strains, North America, May 2013-February 2014[J].Emerg Infect Dis,2014,20(10):1620-1628

[3] Zhao P D, Bai J, Jiang P,et al.Development of a multiplexTaqMan probe-based real-time PCR for discrimination of variant and classical porcine epidemic diarrhea virus[J].J Virol Meth,2014,206: 150-155.

[4] 孫 振.豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR方法和間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014：1-59.

[5] Brian D A, Baric R S. Coronavirus genome structure and replication [J].Cur Topi Microbiol Immunol，2005，287:1-30.

[6] Wang X P,Niu B B,Yan H,et al.Genetic properties of endemic Chinese porcine epidemic diarrhea virus strains isolated since 2010[J].Arch Virol，2013,158(12):2487-2494.

[7] 何啟蓋. 豬腹瀉病的鑒別診斷與防控措施[J]．獸醫(yī)導(dǎo)刊，2011(12) : 22-24．

[8] Wood E N. An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea[J]. Arch Virol，1977,100:243-244.

[9] Takahashi K,Okada K,Ohshima K. An outbreak of swine diarrhoea of a newtype associated with coronavirus-like particles in Japan[J]. Jap J Vet Sci，1983,45: 829-832.

[10] Kweon C H, Kwon B J, Jung T S, et al.Isolation of porcine epidemic diarrhea virus infection in Korea[J]. J Vet Res，1993,33:249-254.

[11] Sozzi E, Luppi A, Lelli D,et al.Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and RT-PCR for the detection of porcine epidemic diarrhoea virus[J].Res Vet Sci，2010,88(1):166-168.

[12] Stevenson G W, Hoang H, Schwartz K J, et al. Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States: clinical signs, lesions, and viral genomic sequences[J]. J Vet Diagn Invest，2013,25(5): 649-654.

[13] 翁善鋼.2014年國(guó)際豬病疫情回顧-豬流行性腹瀉在全球的流行與傳播[J].肉類(lèi)工業(yè)，2015(2):49-50.

[14] 田建興.豬流行性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D].江蘇南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009：1-59.

[15] Tian Y. Molecular characterization and phylogenetic analysis of new variants of the porcine epidemic diarrhea virus in Gansu, China in 2012[J]. Viruses, 2013，5(8)：1991-2004.

[16] Huang Y W, Dickerman A W. Origin, evolution and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States[J]. Mbio, 2013,4(5):e00737-13.

Sequence Analysis of N Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Epidemic Strains in Yunnan Province

SONG Cong1, LIU Ning1, LI Mei-quan1, SHI Yu-you2, LI Hua-chun3, GAO Lin3, YANG Rong-li3, YAO Jun3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China;2.WeishanCenterforPreventionandControlofAnimalDisease,Weishan,Yunnan,672400,China;3.YunnanTropicalandSubtropicalAnimalVirusDiseasesLaboratory,YunnanAnimalScienceandVeterinaryInstitute,Kunming,Yunnan,650224,China)

In order to understand the variation of PEDV epidemic strains in Yunnan Province in recent years, six PEDV positive stool samples, which were collected from four large scale pig farms of different geographical locations and different time, were selected to do RT-PCR, sequencing and sequence analysis. The results showed that nucleotide sequence identity of N gene of TY1, TY2 and TY3 strains was 99.8%, and all this three PEDV strains were collected from the same pig farm in different time. Among them, nucleotide sequence identity of TY1 and TY2 stains was identical, only two mutations had occurr at the 80th and 1238th base pair of N gene sequence of TY3 strain (A→C,C→T).The TY1, TY2, TY3, YXHT, FYDH, Changkou stains of PEDV collected from Yunnan shared 99.2%-100% nucleotide identity with each other. The six Yunnan epidemic strains and three reference strains of German strain GER-L00721-2014(Accession: LM645057.1), French strain KR011756-FR001-2014(Accession: KR011756.1)and Chinese strain JF700126.1-HB-HS-2010(Accession: LM645057.1)shared 98.6%-100% identity, and they were belong to the same evolutionary branch. The nucleotide identity of N gene of the six PEDV Yunnan strains and traditional PEDV live vaccine CV777 strain was 95.2% to 95.5%. There were some variation between the six PEDV Yunnan epidemic strains and CV777 vaccine strain. This might be one of the reasons why the efficiency of immune protection with CV777 vaccine in pig herds in Yunnan is low.

PEDV; N gene; sequence analysis;Yunnan strain

2015-12-08

云南省科技廳重大科技專(zhuān)項(xiàng)(2012ZA017)

宋 聰(1989-),女，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，主要從事豬的營(yíng)養(yǎng)與免疫基礎(chǔ)研究。 *通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)05-0015-05