DNA原位雜交法及斑點雜交法檢測卡氏肺孢子蟲的實驗研究*

常志尚，王 冰，呂 銳，張艷麗，趙 蓉

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，山東青島 266021)

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·論 著·

DNA原位雜交法及斑點雜交法檢測卡氏肺孢子蟲的實驗研究*

常志尚，王 冰，呂 銳，張艷麗，趙 蓉

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，山東青島 266021)

目的 探討DNA原位雜交法及斑點雜交法在卡氏肺孢子蟲檢測中的應(yīng)用。方法 設(shè)計合成卡氏肺孢子蟲特異性寡核苷酸探針，建立卡氏肺孢子蟲大鼠動物模型，分別于第6、8、10周處死動物，取肺組織提取DNA及石蠟切片進(jìn)行斑點雜交及DNA原位雜交，結(jié)果同瑞氏-吉氏染色法比較。結(jié)果 DNA原位雜交法和斑點雜交法第6周檢出陽性結(jié)果，檢出率均為(30/30)，高于瑞氏-吉氏染色法(25/30)。結(jié)論 DNA原位雜交法及斑點雜交法是高效準(zhǔn)確的卡氏肺孢子蟲檢測方法。

卡氏肺孢子蟲； 診斷； DNA原位雜交； 斑點雜交

卡氏肺孢子蟲(PC)是一種機(jī)會性致病病原體,可在免疫功能低下(如艾滋病患者、晚期腫瘤患者)的人群中誘發(fā)卡氏肺孢子蟲肺炎(PCP)，也是導(dǎo)致該類患者死亡的主要原因[1-4]。伴隨著組織器官移植的增多及惡性腫瘤放、化療的開展，PCP的發(fā)病率呈上升之勢[5]。PCP 患者體征輕，癥狀重，病死率高，早期準(zhǔn)確、快速診斷尤其重要。而目前對PC的診斷主要依賴病原學(xué)染色、抗原抗體免疫學(xué)檢測及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等分子生物學(xué)方法,其檢測結(jié)果易受不同操作人員影響波動較大，而難以被推廣應(yīng)用[6]。本研究合成特異性寡核苷酸探針,采用DNA原位雜交及斑點雜交技術(shù)檢測PCP大鼠模型肺組織中的PC,并同瑞氏-吉氏染色法比較，探討DNA原位雜交及斑點雜交法在PCP實驗診斷中的應(yīng)用，以期為臨床診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雌性大鼠,體質(zhì)量約180 g,購自青島實驗動物中心。

1.2 動物模型建立 大鼠隨機(jī)分組，實驗組30只，對照組6只，分籠飼養(yǎng)，飲水中含1 mg/mL四環(huán)素預(yù)防細(xì)菌感染,自由攝食飲水。實驗組大鼠皮下注射地塞米松磷酸鈉注射液1毫克/次,每周2次；對照組不做處理。

1.3 標(biāo)本獲取 于第6、8、10周隨機(jī)抽取實驗組大鼠10只和對照組2只，腹腔注射25%水合氯醛1.5 mL麻醉,取出肺組織,取0.2 g肺組織洗滌勻漿后酚/氯仿法提取核酸；剩余肺組織塊用4 %多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,6 μm 切片[3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(APES)處理玻片]。

1.4 原位雜交

1.4.1 主要試劑 蛋白酶K，焦碳酸二乙酯(DEPC),去離子甲酰胺,鯡魚精子DNA,牛血清白蛋白,聚蔗糖-400,硫酸葡聚糖,地高辛加尾標(biāo)記試劑盒及檢測試劑盒均購自Roche公司。

1.4.2 探針設(shè)計及標(biāo)記 運用DNA Star軟件設(shè)計出PC線粒體核糖體大亞基rDNA基因來源的寡核苷酸探針一條，序列為3′-GGT CTC GCA GAA AAC GAC TTG TTG ATC AG-5′， 探針由上海生工合成。按照標(biāo)記試劑盒說明書對探針進(jìn)行3′端加尾標(biāo)記及探針標(biāo)記效率檢測。

1.4.3 DNA原位雜交檢測 切片經(jīng)脫蠟水化，磷酸緩沖液(PBS)洗5 min×3次，緩沖甲醛液后固定25 min，PBS洗5 min×3次，60 μg/mL蛋白酶K在37 ℃消化15 min，4 ℃預(yù)冷0.2%甘氨酸洗30 s，2×SSC洗1 min，預(yù)雜交液(50%去離子甲酰胺，2×SSC，5×Denhardt液，100 μg/mL鯡魚精子DNA，2%SDS)50微升/片37 ℃預(yù)雜交1 h。甩去預(yù)雜交液，雜交液(0.1 ng/mL地高辛標(biāo)記探針，2×SSC，5×Denhardt液，50%去離子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，2%SDS)25微升/片42 ℃雜交16 h。2×SSC，37 ℃震蕩洗片,5 min×3次。0.5×SSC，震蕩洗片，10 min×3次。BufferⅡ室溫孵育25 min，1∶1 200 稀釋抗DIG-Ab 37 ℃孵育70 min，bufferⅠ洗滌10 min×3次，BufferⅢ平衡2 min，NBT:BCIP顯色1.5 h，水洗，封片。陰性對照為預(yù)雜交液代替雜交液、弓形蟲滋養(yǎng)體涂片、陰道毛滴蟲涂片。陽性對照為卡氏肺孢子蟲肺炎的大鼠BALF涂片。結(jié)果判定：陽性信號為PC的胞質(zhì)呈紫藍(lán)色，陰性對照不顯色。

1.5 斑點印記雜交 將提取的大鼠肺組織DNA樣品溶于TE，95 ℃水浴10 min，冰中速冷5 min，使其變性，分別吸取2 μL按順序加在硝酸纖維素膜上?？鞠?0 ℃烘烤3 h，烘烤固定DNA后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行37 ℃預(yù)雜交2 h、42 ℃雜交16 h，沖洗及顯色，陽性結(jié)果為紫藍(lán)色斑點，觀察結(jié)果并計算陽性率。

1.6 瑞氏-吉氏染色法 切片經(jīng)脫蠟水化，甲醇固定5 min，常規(guī)瑞氏-吉氏染色，陽性結(jié)果為包囊壁為淺紅色，囊內(nèi)小體的細(xì)胞核染成紫紅色、胞質(zhì)藍(lán)色。

2 結(jié) 果

2.1 DNA原位雜交 實驗組大鼠在第6周開始檢測到蟲體,以包囊為主，游離分布,包囊呈橢圓形或圓形，直徑4～7 μm，輪廓明顯，包囊壁著色淺，囊內(nèi)小體著深紫藍(lán)色，清晰可辨(圖1),主要分布在肺泡腔或肺組織內(nèi)；8周時包囊數(shù)量增多，并伴有滋養(yǎng)體出現(xiàn)；10周時檢測到大量滋養(yǎng)體,滋養(yǎng)體形態(tài)不規(guī)則,大小不均一，平均大小1～3 μm,分布在肺泡腔或肺組織內(nèi)，蟲體呈紫藍(lán)色(圖2)，在肺臟小血管壁周圍也有大量蟲體出現(xiàn)。大鼠實驗組肺組織切片PC陽性標(biāo)本檢出30例。

2.2 斑點印跡雜交 應(yīng)用制備的寡核苷酸探針對實驗組及對照組提取的DNA進(jìn)行斑點雜交，第6周可從實驗組大鼠檢測到陽性信號，第8周及第10周陽性信號逐漸增強(qiáng)，大鼠實驗組肺組織PC DNA陽性標(biāo)本檢出30例。

2.3 瑞氏-吉氏染色 瑞氏-吉姆薩染色第6周開始檢出PC包囊及滋養(yǎng)體，其分布及動態(tài)變化與原位雜交結(jié)果相似,但其背景著色深，有非特異性染色的雜質(zhì)干擾，鏡下辨認(rèn)困難。肺印片陽性標(biāo)本檢出25例。

圖1 原位雜交顯示第6周肺組織內(nèi)PC包囊(×1 000)

圖2 原位雜交顯示第10周肺組織內(nèi)的大量PC滋養(yǎng)體(×1 000)

3 討 論

由PC引起的肺部疾病稱為PCP，在免疫功能低下的宿主中有較高的發(fā)病率[3]。目前，國內(nèi)外學(xué)者主要采用糖皮質(zhì)激素造成大鼠免疫抑制誘發(fā)PCP[7]。本實驗采用SD大鼠成功建模，進(jìn)一步驗證該方法的可行性。

診斷PC的可靠方法是病原學(xué)檢查，但在實際操作過程中，其檢出率與標(biāo)本種類、收集方法、染色方法及操作人員經(jīng)驗密切相關(guān)，PC在不同的宿主及生活史階段，其包囊和滋養(yǎng)體的比例也發(fā)生較大的變化，早期感染以包囊較多，晚期滋養(yǎng)體較多[8-9]。使用GMS染色，只能使包囊著色，因此漏檢較多。瑞氏-吉氏法是常見的染色方法，滋養(yǎng)體和包囊均能著色，胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，胞核呈紫紅色，為PC較好的診斷方法,但該法可使周圍背景非特異性著色,并且滋養(yǎng)體與血小板間識別困難[10]。

核酸分子雜交技術(shù)是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，分為膜上印跡雜交和核酸原位雜交。印跡雜交需提取待測樣品DNA或RNA，將其轉(zhuǎn)移到固相支持膜上，再與已標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。核酸原位雜交是使用特定標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交檢測的方法。原位雜交技術(shù)不需要提取核酸，能夠在組織細(xì)胞中進(jìn)行單一靶細(xì)胞的研究而不受其他成分的影響，對于含量很低的靶序列也有很高的敏感性，并可保持組織細(xì)胞形態(tài)的完整，便于定位研究,對于散在于其他組織中的病原體或細(xì)胞的研究十分方便。核酸雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于特定基因表達(dá)水平的檢測，染色體基因定位及微小病原體檢測。寡核苷酸探針屬核酸探針的一種，由DNA合成儀合成，其制備不受酶切位點的影響，獲取方便。寡核苷酸探針為單鏈DNA，不易降解。探針長度短，穿透性較好。核酸雜交技術(shù)用于PC檢測方面的報道，多使用隨機(jī)引物法制備探針，采用Nothern、Southern雜交及PCR技術(shù)[9，11]。目前為止，我國尚少見使用寡核苷酸探針采用DNA原位雜交法及斑點印跡法檢測PC的報道。

本實驗以寡核苷酸探針成功采用斑點印跡法檢測PC DNA，陽性結(jié)果為紫藍(lán)色斑點，無背景噪聲，對比度好，判別簡單，陽性率為100%(30/30)，優(yōu)于瑞氏-吉氏法(25/30)。該方法具有操作簡便的優(yōu)點，即使沒有經(jīng)過寄生蟲專業(yè)培訓(xùn)的人員也可掌握；其缺點是不能觀察到蟲體的形態(tài)及蟲體與宿主組織細(xì)胞間的相互關(guān)系。

實驗中DNA原位雜交能清晰顯示肺組織中PC包囊和滋養(yǎng)體的形態(tài)，蟲體遍布陽性信號，呈深紫藍(lán)色，邊緣清楚，背景不著色，對于散在的少量蟲體也能清晰著色。探針用量僅0.08 ng/μL時也能獲得可靠結(jié)果，靈敏度高。本實驗中，在感染后第6周檢測到散在的單個蟲體，表明在有較輕程度感染時，原位雜交法也能清晰顯示，靈敏度高。陽性率為100%(30/30)，與斑點印跡法相同，優(yōu)于瑞氏-吉氏法。

綜上所述，采用寡核苷酸探針斑點印跡法和DNA原位雜交技術(shù)檢測出感染組織內(nèi)的蟲體，靈敏度高，結(jié)果判讀簡單。兩種方法可互補使用，斑點印跡法可側(cè)重于快速定性診斷，DNA原位雜交法可側(cè)重于蟲體形態(tài)及蟲體與宿主相互作用的研究。

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Experimental study on DNA in situ hybridization and dot blotting for detecting pneumocystis carinii*

CHANGZhishang,WANGBing,LVRui,ZHANGYanli,ZHAORong

(PathogenBiologyLaboratory,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266021,China)

Objective To investigate the application of DNA in situ hybridization and dot blotting for the detection of Pneumocystis carinii.Methods Pneumocystis carinii specific oligonucleotide probe was designed and synthesized.The Pneumocystis carinii rat models were constructed and sacrificed at 6,8,10 weeks after constructing model.The lung tissues wer taken for making paraffin sections.Then the dot blotting and DNAin situ hybridization were performed.The results were compared parallelly compared with those obtained by the Wright-Giemsa′s staining.Results The positive results were detected at 6 weeks.The detection rate was 30/30,which wa higher than 25/30 in the Wright-Giemsa′s staining.Conclusion DNA in situ hybridization and dot blotting are the efficient and accurate method for the detection of Pneumocystis carinii.

Pneumocystis carinii; diagnose; DNA in situ hybridization; dot blotting

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0446)。

常志尚，男，實驗師，主要從事原蟲分子生物學(xué)及超微結(jié)構(gòu)研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.004

A

1673-4130(2016)24-3393-03

2016-09-08

2016-10-27)