洋蔥S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及分析

王 晶，劉恩科，王永勤

（1.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033001；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京100097）

洋蔥S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及分析

王 晶1，劉恩科2，王永勤3

（1.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033001；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京100097）

根據(jù)洋蔥轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計了S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（AcSAMS）引物，利用RT-PCR技術(shù)和RACE技術(shù)克隆了洋蔥S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA全長，命名為AcSAMS。該cDNA全長1 475 bp，ORF為1 191 bp，編碼396個氨基酸的多肽。生物信息學(xué)分析表明，AcSAMS氨基酸序列與紫萼同源性為95%，與短花藥野生稻為94%，與桔梗和粳稻為93%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，AcSAMS與唐菖莆SAMS的親緣關(guān)系最近。該基因的克隆可為進(jìn)一步研究AcSAMS在抗旱、抗凍、耐鹽等抗逆過程中的作用機(jī)理提供理論依據(jù)，為開展抗逆基因工程奠定基礎(chǔ)。

洋蔥；S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因；克??；分析

S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS，EC：2.5.1.6）是生物體內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它催化三磷酸腺苷（ATP）和L-甲硫氨酸（Met）反應(yīng)合成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）[1]，也是目前已知的生物體內(nèi)合成SAM的唯一途徑。SAM是廣泛存在于生物中的一種生理活性分子，也是S-腺苷甲硫氨酸代謝途徑關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，參與轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫、轉(zhuǎn)氨丙基等反應(yīng)[2-4]。SAM作為主要的甲基供體，在大多數(shù)甲基化反應(yīng)中起著核心作用，如核酸、蛋白質(zhì)、脂類和多糖的甲基化[5]。它參與多種不同的代謝過程，其中主要有合成多胺（精胺、亞精胺和腐胺等）、乙烯及谷胱甘肽[6]。此外，SAM還可與RNA結(jié)合參與體內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)控[6-7]。因此，研究SAMS基因功能對植物具有重要的意義。

目前，多種植物中SAMS的cDNA已被克隆出來，如擬南芥[7-8]、小麥[9]、楊樹[10]、石蒜[11]、蕪菁[12]、松樹[13]、大白菜[14]、芥菜[15-16]和杜梨[17]，但是未見洋蔥SAMS基因的報道。由于SAMS的重要生物學(xué)功能，存在多種類型的SAMS基因，它由一個多基因家族所編碼，共同調(diào)節(jié)著SAM的合成速率。因此，克隆不同物種的SAMS基因具有重要的意義。

洋蔥（Allium cepa L.）為蔥科（Liliaceae）蔥屬（Allium）2年生草本蔬菜作物，是重要的世界性蔬菜，也是我國主要栽培和出口蔬菜品種，具有較強(qiáng)的抗凍、抗旱能力。本研究擬以洋蔥為材料，克隆SAMS基因，并對其序列特征進(jìn)行分析，旨在為研究AcSAMS在洋蔥抗旱和耐凍過程中的作用機(jī)理提供理論依據(jù)，為開展洋蔥抗性分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以紅皮洋蔥葉片為材料提取RNA。

根據(jù)洋蔥轉(zhuǎn)錄組測序獲得的SAMS基因的中間片段序列，設(shè)計了RACE引物。本研究所需引物如表1所示。

表1 引物及序列

1.2 總RNA提取及第1鏈cDNA合成

用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）提取洋蔥葉片總RNA。提取總RNA的操作步驟按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

利用B26作為引物，以3 μg總RNA作為模板，合成cDNA第1鏈。第1鏈cDNA合成的反應(yīng)體系及具體操作步驟參照PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）說明書進(jìn)行。

1.3 RACE

1.3.1 利用3′-RACE技術(shù)擴(kuò)增AcSAMS基因3′端序列 以合成的第1鏈cDNA為模板，利用C1與B26引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增3′末端序列。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2 min；94℃40 s，55℃30 s，72℃2 min，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 利用5′-RACE技術(shù)擴(kuò)增AcSAMS基因5′端序列 其參照李洪有等[18]的方法，略有改進(jìn)。

TdT加Poly（C）尾反應(yīng)：在加入加尾反應(yīng)試劑前，將純化好的20 μLcDNA在94℃下變性6 min，之后再在冰上冷卻1 min，按照如下體系加入反應(yīng)試劑：5×TdT Buffer（10 μL），0.1%BSA（5 μL），100 mmol/L dCTP（0.8 μL），TdT（15 U）和ddH2O（補至總體積50 μL），置于PCR儀中37℃1 h，65℃10 min進(jìn)行加尾反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增：采用巢式PCR策略，進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增。第1輪擴(kuò)增以加尾的cDNA為模板，以引物AP和基因特異引物C2為上下游引物。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，62～54℃30 s（62～54℃每次降2℃，其中，54℃前每個溫度2個循環(huán)，最后54℃27個循環(huán)），72℃1 min，共35個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存?zhèn)溆谩５?輪PCR反應(yīng)以第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以巢式引物NP和基因特異引物C2為上下游引物。PCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性1 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）回收目的條帶?；厥盏漠a(chǎn)物連接到 pEASY-T1載體（TransGen Biotech公司）上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選，挑白斑搖菌過夜培養(yǎng)。經(jīng)檢測為陽性菌株送北京三博生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.4 序列分析及其系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將一步RT-PCR及RACE獲得的cDNA序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，得到目的基因的全長cDNA序列。將該基因推測的氨基酸序列和來自NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種的同源序列進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。蛋白序列比對用Clustalx2.0軟件進(jìn)行。系統(tǒng)發(fā)育樹用MEGA5.0軟件中的鄰近相連法進(jìn)行構(gòu)建，并進(jìn)行Bootstrap檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及序列分析

采用一步RT-PCR擴(kuò)增獲得一條386 bp的3′端目的片段（圖1-A），測序結(jié)果表明，該片段長度約為400 bp。利用TdT加尾5′-RACE方法，PCR擴(kuò)增后得到一個約為540 bp的5′端目的片段（圖1-B）。利用軟件DNAMAN將3條序列進(jìn)行比對去除重疊部分并進(jìn)行拼接，得到長度為1 475 bp的基因全長cDNA序列，命名為AcSAMS。

對AcSAMS全長序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該基因全長cDNA序列包含1個80 bp的5′非編碼區(qū)；1個1 191 bp完整的開放閱讀框（ORF），編碼396個氨基酸，推測蛋白分子量為43.13 kD，等電點為5.568；1個204 bp的3′非編碼區(qū)，該非編碼區(qū)含有植物mRNA典型的Poly（A）尾序列（圖2）。

2.2 氨基酸序列比對及其系統(tǒng)發(fā)育分析

AcSAMS基因編碼396個氨基酸殘基，其中，堿性（+）氨基酸（K，R）42個、酸性（-）氨基酸（D，E）54個、疏水氨基酸（A，I，L，F(xiàn)，W，V）133個、極性氨基酸89個。對AcSAMS基因編碼蛋白序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，其中，26.52%的氨基酸殘基構(gòu)成α-螺旋（alpha helix），14.39%的氨基酸殘基構(gòu)成β-折疊（beta sheet），59.09%的氨基酸殘基構(gòu)成隨機(jī)卷曲（randomcoil）。

將AcSAMS基因推測的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中執(zhí)行BLASTx比對檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與紫萼同源性為95%；與短花藥野生稻為94%；與桔梗和粳稻為93%。將洋蔥AcSAMS的氨基酸序列與其他來源于不同物種的SAMS氨基酸序列進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，AcSAMS包含SAMS的特征序列，分別為GHPDK（第17～21位氨基酸殘基）、GAGDQGhmfGY（第122～132位氨基酸殘基）和GGGAFSgKD（第269～277位氨基酸殘基）。

為了進(jìn)一步研究洋蔥種子AcSAMS基因與其他物種SAMS基因之間的關(guān)系，用MEGA 5.0軟件采用鄰近相連法構(gòu)建了AcSAMS的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，洋蔥AcSAMS基因與唐菖莆的SAMS聚在一起，表明它們的親緣關(guān)系最近。

3 討論

腺苷甲硫氨酸，在動植物體內(nèi)廣泛存在，具有重要的生理生化作用。它參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)多胺的形成，對植物抗逆性具有重要作用。大量數(shù)據(jù)表明，SAMS基因受干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，例如糜子[19]的SAMS基因受干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，鹽地堿蓬[20]、大洋洲濱藜[21]、煙草[22]、陸地棉[23]等的SAMS基因受鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。蝴蝶蘭SAMS基因參與了蝴蝶蘭低溫脅迫的分子調(diào)控[24]；SAMS基因在甘蔗抗寒、抗旱、抗鹽和抗氧化等脅迫過程中也起某種作用[25]。將鹽地堿蓬的SsAMS2轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株中多聚胺含量顯著高于未轉(zhuǎn)基因煙草，且其耐鹽性也比未轉(zhuǎn)基因煙草提高[26-27]。在洋蔥的抗旱和耐鹽過程中，AcSAMS基因的組織表達(dá)模式和作用方式都有待進(jìn)一步研究。

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Molecular Cloning and Bioinformatic Analysis of S-adenosylmethionine Synthetase Gene from Allium cepa

WANG Jing1，LIU En-ke2，WANG Yong-qin3
（1.Department of Life Sciences，Lyuliang University，Lyuliang033001，China；2.Research Center of Arid Farming，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture，Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing100097，China）

Primers of S-adenosylmethionine synthetase gene were designed based on the result of onion transcriptome sequencing, and full-length cDNA of S-adenosylmethionine synthetase gene in onion was cloned using RT-PCR combined with RACE technology, named AcSAMS.The total length ofcDNA was 1 475 bp and its ORF encoding a polypeptide of396 amino-acid residues was 1 191 bp. Bioinformatics analysis showed that the homology between the amino acid sequence of AcSAMS and grimmia was 95%,and the short anthers of wild rice was 94%,and the japonica and platycodon grandiflorum were 93%,respectively.The dendrogram result indicated that the closest genetic relationship existed in AcSAMS and SAMS Gladiolus grandiflorus.The cloning of the gene lays a foundation for further research on the functional mechanism of AcSAMS in the process of drought resistance and salt tolerance and the development of genetic improvement.

onion;AcSAMS;cloning;analysis

S633.2

A

1002-2481（2016）05-0575-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.02

2016-03-17

國家自然科學(xué)基金項目（31372066）；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（KJCX201101010）

王 晶（1993-），女，山西興縣人，在校學(xué)生，研究方向：分子生物學(xué)。劉恩科、王永勤為通信作者。