豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫效力的研究

魏 冰，陳文娟，李建軍，呂傳忠，任東興，陳 庚，付旭彬*

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308）

豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫效力的研究

魏 冰1，陳文娟1，李建軍1，呂傳忠2，任東興2，陳 庚2，付旭彬2*

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308）

為了解豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫28 d后是否能夠增強對易感仔豬的免疫效力，本研究將豬O型口蹄疫合成肽抗原乳化后按1頭份、1/3頭份和1/9頭份三組劑量分別免疫易感仔豬。在免疫第28 d檢測仔豬血清中的中和抗體滴度及攻毒保護試驗檢測PD50。結(jié)果顯示：1頭份劑量組VP1抗體滴度最高達1:45，且顯著高于其他劑量組VP1抗體滴度（P<0.05）；1/3頭份劑量組VP1抗體滴度最高達1:22，1/9頭份劑量組VP1抗體滴度均為1:16，該兩組間無顯著差異（P>0.05）。豬O型口蹄疫合成肽疫苗能夠有效抵抗O/GX/09-7毒株和JMS毒株的侵襲，增強了易感仔豬對該兩種病毒的免疫保護力。

口蹄疫病毒；Th表位肽；疫苗免疫增強劑；合成肽疫苗；抗體滴度；攻毒保護

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）是一類小型RNA病毒，被定義為口蹄疫病毒屬。一經(jīng)發(fā)現(xiàn)口蹄疫疫情，按法律規(guī)定必須上報世界動物衛(wèi)生組織（OIE）[1]，它給畜牧產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。免疫注射口蹄疫疫苗是公認有效的預防口蹄疫病毒的方法之一，臨床上主要使用全病毒滅活疫苗和合成肽疫苗對易感動物進行防治。合成肽疫苗存在無須操作全病毒，安全性高，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)工藝簡單等優(yōu)點[2]，被人們認為是一種安全、可靠的防治口蹄疫疫病的疫苗。然而，口蹄疫合成肽疫苗的免疫劑量、免疫效力以及有效保護率仍需通過相關(guān)試驗進一步確定。

自1982年有學者提出一種新型口蹄疫疫苗[3]，即合成肽疫苗，F(xiàn)MDV的表位蛋白研究不斷深入，對于疫苗的免疫效力檢測方法也不斷更新。倪衛(wèi)忠等[4]對包括免疫球蛋白IgG、IgM等和免疫后VP1抗體滴度的檢測評價了口蹄疫病毒的免疫應答成效。還有研究人員[5]通過血清細胞因子IFN-γ、CD8+T淋巴細胞、三種VP1的表達水平分別對比了兩種口蹄疫病毒合成肽疫苗的免疫效力。大量研究表明，口蹄疫合成肽疫苗對于口蹄疫的防治起到一定成效。至2014年，農(nóng)業(yè)部正式批準了一類合成肽疫苗成為新獸藥[6]。本試驗通過檢測O型口蹄疫合成肽疫苗的VP1抗體滴度及PD50，期望能為提升疫苗安全性，確保疫苗穩(wěn)定性，明確疫苗最佳免疫量提供一些參考。

1 材料與方法

1.1試驗動物及分組30只體重為40 kg左右的易感仔豬（FMDV中和抗體效價不高于1:8或ELISA抗體效價不高于1:8）。該批仔豬購自云南省飼養(yǎng)散戶于云南省生物制品研制中心基地圈養(yǎng)，隨機分成A、B、C三組，每組10只，并用耳標編號。

1.2檢驗用毒株口蹄疫O型病毒（O/GX/09-7株）、口蹄疫O型病毒（JMS株）由云南省生物制品研制中心提供，攻毒試驗于云南省生物制品研制中心P3實驗室進行。

1.3主要試驗試劑和儀器豬O型口蹄疫合成肽抗原由瑞普生物技術(shù)股份有限公司提供；MONTANIDE ISA 61VG佐劑（批號：T30311)，購自賽彼科（上海）特殊化學品有限公司；豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（批號：2014092301），購自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司；酶標檢測儀（Bio-RAD15146型），購自美國伯樂公司。

1.4試驗方法

1.4.1 動物免疫 將乳化后的豬O型口蹄疫合成肽抗原分別耳后根肌肉注射仔豬，根據(jù)中華人民共和國獸藥典半數(shù)保護量測定法通則分為：A組為1頭份劑量組（1.0 mL），B組為1/3頭份劑量組（0.33 mL），C組為1/9頭份劑量組（0.11 mL），免疫28 d后收集血清并攻毒[7]。

1.4.2 間接ELISA檢測血清VP1抗體 操作步驟嚴格按照上海優(yōu)耐特豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒說明書進行。

1.4.3 PD50檢測 接種后28 d，將每個劑量組分為兩小組，5頭/組進行攻毒試驗，其中一組每頭豬耳根后肌肉注射2 mL毒價為103TCID50的/O/GX/09-7株乳鼠毒；另一組每頭豬耳根后肌肉注射2 mL毒價為103TCID50的JMS株乳鼠毒。連續(xù)觀察10 d。對照豬均應至少有一蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫豬出現(xiàn)任何口蹄疫癥狀即判為不保護。出現(xiàn)發(fā)病豬后要及時進行隔離。根據(jù)免疫豬的保護數(shù)，按Reed-Muench法計算被檢疫苗的PD50。即l g PD50=l g（高于50%劑量組）+距離比例 ×l g（高于50%劑量組）[8]。

1.5統(tǒng)計學分析本試驗所有試驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0進行分析，統(tǒng)一表示為平均值±標準差（X±SE），采用獨立樣本t檢驗比較組間差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1血清VVPP11抗體檢測結(jié)果采用間接ELISA方法檢測免疫仔豬28 d后的血清VP1抗體效價。結(jié)果顯示，1頭份劑量組VP1抗體滴度最高達1:45；1/3頭份劑量組VP1抗體滴度最高達1:22；1/9頭份劑量組VP1抗體滴度均為1:16，且1頭份劑量組VP1抗體滴度顯著高于1/3頭份劑量組和1/9頭份劑量組（P＜0.05），詳見表1。

2.2PPDD5500檢測結(jié)果每個劑量組分兩組分別耳后肌肉注射2 mL O/GX/09-7株乳鼠毒和MS株乳鼠毒，連續(xù)觀察10 d后，試驗結(jié)果顯示：攻O/GX/09-7株乳鼠毒的，1頭份劑量組保護率達4/5，1/3頭份劑量組保護率達5/5，1/9頭份劑量組保護率達2/5；攻MS株乳鼠毒的，1頭份劑量組保護率達5/5，1/3頭份劑量組保護率達5/5，1/9頭份劑量組保護率達5/ 5。攻O/GX/09-7株乳鼠毒后，PD50為10-0.8112頭份，即O型口蹄疫合成肽疫苗接種0.155頭份便可以使50%易感仔豬獲得保護，每頭份疫苗含6.45 PD50；攻JMS株乳鼠毒后，O型口蹄疫合成肽疫苗PD50為10-1.19頭份，即O型口蹄疫合成肽疫苗接種0.064頭份便可以使50%易感仔豬獲得保護，每頭份疫苗含15.59PD50，詳見表2。

表1 免疫仔豬血清抗體滴度Table1 Antibody of piglets in its serum after immunity

表2 仔豬免疫后攻毒PD50情況Table2 PD50of piglets after toxicity attack

3 討論

我國與世界動物衛(wèi)生組織評價疫苗效力最直接數(shù)據(jù)是病毒中和抗體檢測和動物免疫保護力檢測[9]。本研究通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗對免疫豬O型口蹄疫合成肽疫苗的仔豬血清進行口蹄疫VP1抗體滴度檢測以及免疫后28 d攻毒試驗檢測PD50，評價了本試驗使用的豬O型口蹄疫合成肽疫苗的免疫效力。免疫28 d后，豬O型口蹄疫合成肽疫苗能夠顯著增加仔豬血清中VP1抗體滴度。通過對免疫了豬O型口蹄疫合成肽疫苗的仔豬進行PD50檢測試驗顯示，本試驗所用豬O型口蹄疫合成肽疫苗對兩種毒株的免疫效力均大于6，且攻毒保護率結(jié)果理想，效力穩(wěn)定。其中，豬O型口蹄疫合成肽疫苗對JMS毒株的抵抗力尤為顯著。豬O型口蹄疫合成肽疫苗成功出世對口蹄疫疫苗的發(fā)展起到了很大的推動作用，研究人員在新型口蹄疫防治方法的安全性、免疫效力和經(jīng)濟成本方面也取得進步。趙利平等[10]通過對O型基因工程疫苗的免疫保護試驗進行研究，得到該疫苗大于3的免疫效力，且為基因工程疫苗的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定研究基礎(chǔ)。

本試驗中合成肽疫苗的免疫效力大于6，在免疫保護率方面表現(xiàn)了比基因工程苗更好的優(yōu)越性，但合成肽疫苗的穩(wěn)定性仍需大量試驗數(shù)據(jù)支持，離大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)仍存在一些問題亟需解決。王繼華等[11]對現(xiàn)有O型口蹄疫滅活苗進行超濾濃縮后免疫，最終進行攻毒保護試驗，認為濃縮抗原后可顯著提升牛口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型二價滅活疫苗免疫效果。而本試驗中的口蹄疫病毒合成肽系病毒表面的兩段主要氨基酸序列，結(jié)果中出現(xiàn)1頭份免疫劑量保護率小于1/3頭份免疫劑量保護率現(xiàn)象，分析可能與合成肽疫苗免疫最佳劑量并非越高越好有關(guān)，如若想達到更好的免疫效果和更高的PD50，建議嘗試抗原合成肽的濃縮純化等方式，其對野毒產(chǎn)生免疫保護的抗原量有待進一步研究。

4 小結(jié)

該試驗從獸藥典公認的抗體水平和動物免疫保護力方面證明瑞普生物技術(shù)股份有限公司提供的豬O型口蹄疫合成肽疫苗對O/GX/09-7株乳鼠毒和MS株乳鼠毒有一定的抵抗作用，能夠保護易感仔豬免受該兩種毒株侵襲，為口蹄疫疫苗的最佳免疫劑量提供參考。

[1]MASON P W,GRUBMAN M J,BAXT B.Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J]. Virus Research,2003,91(1):9-32.

[2]馮俊吾，潘志榮.口蹄疫流行現(xiàn)狀的分析及防控措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)，2008（3）：100-101.

[3]張伯澄.一種新型的口蹄疫疫苗——合成肽疫苗[J].獸醫(yī)科技雜志，1983.

[4]倪衛(wèi)忠，孫泉云.動物對口蹄疫病毒的免疫應答及口蹄疫疫苗的質(zhì)量評估[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（16）：273-274.

[5]Feng Shan Gao,Lei Feng,Qiang Zhang,et al. Immunogenicity of Two FMDV Nonameric Peptides Encapsulated in Liposomes in Mice and the Protective Efficacy in Guinea Pigs[J]. Plos One,2013,8(7)：1-9.

[6]刊輯.農(nóng)業(yè)部批準兩種豬口蹄疫O型合成肽疫苗產(chǎn)品[J].中國豬業(yè)，2014（7）：67.

[7]尹成杰.中國獸藥典[S].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.2011：附錄7.

[8]郎洪武，王樂元，王家福，等.豬口蹄疫O型滅活疫苗PD50效檢攻毒劑量試驗[J].中國獸藥雜志，2004，38（12）：9-10.

[9]李樂，信愛國，廖得芳，等.中和抗體滴度檢測口蹄疫疫苗效果的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2009，31（3）：231-235.

[10]趙利平，劉玉梅，劉國英，等.豬口蹄疫O型基因工程疫苗免疫保護試驗[J].畜牧與飼料科學，2013，34（2）：8-9.

[11]王繼華，邵明，施程洪，等.抗原濃縮純化工藝對口蹄疫滅活疫苗免疫效果評價[J].中國獸醫(yī)學報，2011，31（5）：684-686.

Research on the immune effection of Type-O Foot and Mouth Disease Synthetic Peptide Vaccine

Wei Bing1,Chen Wenjuan1,Li Jianjun1,Lv Chuanzhong2, Ren Dongxing2,Chen Geng2,Fu Xubin2*
（1.Animal Science and Animal Medicine College,Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384; 2.Tianjin Ringpu Biological Technology co.,LTD,Tianjin 300308)

In order to study the immunity enhancement when imuned type-O Foot and Mouth Disease synthetic peptide vaccines for piglets after 28 d.The antigen peptides of type O Foot and Mouth Disease was divided into 1、1/3 and 1/9 doses per piglets after its emulsified.Detect the VP1 antibody of serum and PD50immunity protective test.The results show that VP1 antibody of 1 per piglets was significantly higher than other group(P<0.05),and its higest antibody titer was 1:45; VP1 antibody of 1/3 per piglets’higest antibody titer was 1:22 and VP1 antibody of 1/9 per piglets’higest antibody titer was 1:16;there were no significant differences between the latter two groups(P>0.05).The synthetic peptide vaccines of type O FMDV can effectively resist O/GX/09-7 strains and JMS strains,.It can enhance the susceptibility of the two kinds of piglets virus immune protection.

Foot-and-mouth disease virus;The epitope peptides;Immunopotentiator;Synthetic peptide vaccine;AAntibody titer;Protective efficacy

S852.659.6

B

1672-9692(2016)05-0009-04

2016-04-20

魏冰（1990-），女，碩士，預防獸醫(yī)學專業(yè)。

付旭彬（1975-），男，碩士，研究員，技術(shù)發(fā)展部總監(jiān)，主要從事獸醫(yī)生物技術(shù)與疫苗研究。

畜禽用合成肽新型疫苗的國際合作研究。