鵝細小病毒HN株的分離鑒定及全基因組序列分析

賀冬梅，譚樹義，陳朝喜，葉保國，張 艷，林哲敏，曹宗喜*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，海南?？?571100；2.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041)

鵝細小病毒HN株的分離鑒定及全基因組序列分析

賀冬梅1,2，譚樹義1，陳朝喜2，葉保國1，張 艷1，林哲敏1，曹宗喜1*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，海南海口 571100；2.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041)

為研究鵝細小病毒(GPV)基因遺傳變異特征，采集海南某養(yǎng)鵝場疑似鵝細小病毒感染的病料，將其處理后接種番鴨胚成功分離到一株病毒，經(jīng)PCR鑒定為鵝細小病毒，命名為HN株,并獲得了其全基因組序列，將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的16條鵝和番鴨細小病毒基因序列進行了比對分析。結果顯示，該株病毒基因組全長為5 106 bp，由ITR、NS、VP構成，其中ITR為444 bp,NS1為1 844 bp，VP1為2 199 bp；HN株與SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分別達到99.8%和99.7%，與番鴨細小病毒株FM的NS1基因同源性最低,為82.7%；與90-0215株VP1同源性最低，為80.1%。HN株的遺傳進化樹可以看出，GPV可以分成明顯的2個基因亞群，HN株與鵝細小病毒匈牙利株(B)、歐洲疫苗株(VG32/1)和臺灣株(82-0321V、82-0321、06-0329)均處在第I亞群,且與安徽分離株Y株以及SHFX1201株同源性最接近，番鴨源匈牙利株FM單獨處于第Ⅱ亞群。本研究豐富了GPV的數(shù)據(jù)資料,為研究GPV分類地位以及遺傳進化關系提供了依據(jù)，同時也為研究GPV流行趨勢和疫苗的開發(fā)奠定了基礎。

鵝細小病毒；分離鑒定；全基因組；IRT；NS1；VP1

鵝細小病毒病又稱小鵝瘟(Derzsy′s disease or Gosling plaque)，是由鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)所引起的雛鵝急性或亞急性的敗血性傳染病。臨床上以精神委靡，離群獨偶，鼻孔流出漿液性鼻液，患鵝頻頻搖頭，拉灰黃色或黃綠色稀糞，神經(jīng)紊亂，小腸中后段黏膜壞死脫落與纖維素性滲出物凝固形成栓子，形如臘腸狀為特征。本病常呈敗血經(jīng)過，發(fā)病率和病死率很高，對養(yǎng)鵝業(yè)危害極大[1-2]。GPV為單鏈線性DNA病毒，其基因組約5 kb，在基因組的兩端均含有相同的末端倒置重復序列(inverted terminal repeat，ITR)可折疊形成U形雙鏈發(fā)夾結構，其主要功能是病毒的復制起點并提供順式包裝信號，中間有2個開放閱讀框，左側編碼非結構蛋白NS1和NS2，主要參與病毒的復制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；右側編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，VP3是GPV的免疫保護抗原，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體[3-4]。

本研究通過在海南疑似鵝細小病感染的病料中分離到1株疑似鵝細小病毒，進行分離鑒定后確定為鵝細小病毒，且命名為HN株，并對其全基因組序列進行分析，豐富了我國鵝細小病毒基因組數(shù)據(jù)資料，為研究該病的流行、基因遺傳進化特征及指導小鵝瘟的防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 由本實驗室采集并保存的海南某養(yǎng)鵝場疑似GPV感染雛鵝組織(肝臟、脾臟等組織樣品)。

1.1.2 試劑 瓊脂糖、膠回收純化試劑盒、pMD18-T載體、大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞、LATaqDNA聚合酶、DNA Maker DL 2 000等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中GPV標準株的全基因組序列設計7對引物，引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

1.2.2 樣品處理 采集發(fā)病雛鵝的肝臟和脾臟剪碎研磨，按1∶3加入滅菌生理鹽水，反復凍融3次，5 000 r/min離心10 min取上清液，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，置-70 ℃保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.3 病毒分離鑒定 將凍存疑似GPV樣品用前加入終濃度為10 000 IU的青霉素和鏈霉素4 ℃感作1 h，接種10日齡健康鵝胚(0.3 mL/枚)，棄去24 h 內(nèi)死亡的鵝胚，收取24 h后死亡的鵝胚尿囊液，盲傳3代，置-20 ℃保存，并將培養(yǎng)物進行PCR檢測[6-7]。

1.2.4 PCR鑒定 按照DNA抽提試劑盒說明進行DNA提取，PCR反應體系為LATaq10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，滅菌雙蒸水6 μL，直接進行PCR擴增。PCR反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5 全基因組的擴增、克隆及序列測定 按照DNA抽提試劑盒說明進行基因組DNA提取，將提取物進行PCR，反應體系：LATaq10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，滅菌雙蒸水6 μL，直接進行PCR擴增。PCR擴增反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72℃ 150 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物200 μL，在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐西林篩選和菌液PCR鑒定后，取陽性菌液送上海英駿生物技術公司進行測序[8-9]。用Lasergene 7.1軟件進行序列拼接，并將拼接后的全基因序列向GenBank提交，進行序列分析。

1.2.6 鵝細小病毒參考毒株 本分析中使用的細小病毒參考株見表2。

表1 本研究所用引物

Table 1 Primers used in this study

引物名稱Primername引物序列(5'～3')Primersequence(5'-3')擴增長度/bpAmplificationlengthFRTATCAACAACCAYTGGGGAATTCTGCTGCTGTCTACCTCAT470A1FA1RTCATTGGAGGGTTCGTTCGTGCATGCGCGTGGTCAACCTAACAGCCGGAAA202A2FA2RGCATGCCGCGCGGTCAGCCCAATATTCGTCCTGGTTGAACTGATT585A3FA3RGTCGGAGAGATGGCACTTTCTGTGGTGGCAGGTCCGTAGAGC1028A4FA4RCTTCTTCAAATAATAGACAAGTGTAGACATATCTGCTTTGAGTC1137A5FA5RATGAACATGGGTGGTATGATTACTAGAATGCACTCCGGTCAT1297A6FA6RAACCATTGGGGAATCAGACCGCATGCGCGTGGTCAACCTAACAGCCGGAAA1574

表2 GPV全基因參考毒株

Table 2 Reference strains of GPV full genomes used in this study

毒株Virus宿主Host分離時間Yearofisolation登錄號GenBank№來源GeographicoriginGPV-YG鵝Goose2001AF416726中國ChinaHG5/82鵝Goose2003AY506546中國ChinaFM番鴨Muscovyduck1980U22967匈牙利HungaryHBZF07鵝Goose2007EU022755中國ChinaLN-1/06鵝Goose2007EU253479中國(遼寧)China(Liaoning)82-0321V鵝Goose1982EU583389中國(臺灣)China(Taiwan)82-0321鵝Goose1982EU583390中國(臺灣)China(Taiwan)06-0329鵝Goose2006EU583391中國(臺灣)China(Taiwan)VG32/1鵝Goose-EU583392歐洲EuropeB鵝Goose1960U25749匈牙利HungaryGDaGPV鵝Goose1978HQ891825中國(福建)China(Fujian)SH鵝Goose2009JF333590中國(上海)China(Shanghai)Y番鴨Muscovyduck2011KC178571中國(安徽)China(Anhui)E鵝Goose2012KC184133中國(安徽)China(Anhui)SHFX1201天鵝swan2012KC478066中國ChinaYZ99-6鵝Goose1999KC996730中國China90-0215鴨Duck2003AY382891中國ChinaGD鵝Goose2003AY512830中國(廣東)China(Guangdong)SCh鵝Goose2007EU088101中國(四川)China(Sichuan)

2 結果

2.1 GPV分離鑒定

將疑似GPV感染的病料進行DNA提取后，以GPV的F/R為引物進行PCR檢測(圖1)，然后將檢測為陽性樣品接種鵝胚，死亡鵝胚頭部和背部出血(圖2)，取鵝胚培養(yǎng)物進行PCR檢測(圖3)。由圖1、圖3可知，檢測樣品有約470 bp的目的條帶出現(xiàn)，與預期大小一致。

M.DNA標準DL 2 000；1～3.病料處理樣品；4.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1-3.PCR products of treated samples;4.Negative control

圖1 病料PCR擴增結果

Fig.1 PCR amplification results of samples

圖2 接毒后死亡的鵝胚

2.2 全基因組特征

GPV HN株經(jīng)PCR擴增后獲得其全基因組序列，各片段大小分別為0.2、0.5、1.0、1.1、1.2、1.5 kb，結果與預期的片段大小一致(圖4)。獲得GPV HN株基因組全長為5 106 bp，并由ITR、NS、VP構成，其中NS1為1 844 bp，VP1為2 199 bp，符合GPV的結構特征，且與2011年在安徽分離的Y株以及2012年在天鵝上分離到的SHFX1201株的全基因組同源性最高，分別為99.3%和99.6%。該株病毒有左右兩側兩個開放閱讀框，左側編碼非結構蛋白(NS1和NS2)，右側編碼結構蛋白(VP1、VP2和VP3)。其結構蛋白基因NS1(537-2 420 nt)主要編碼627個氨基酸，NS2編碼451個氨基酸；其衣殼蛋白基因VP1(2 439-4 637 nt)編碼732個氨基酸，

VP2(2 874-4 637 nt)基因編碼587個氨基酸，VP3(3 033-4 637 nt)基因編碼534個氨基酸，在其右側的ITR前有1個Poly(A)的尾。

M.DNA標準DL 2 000；1～5.培養(yǎng)物樣品；6.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-5.PCR products of culture samples;6.Negative control

圖3 培養(yǎng)物PCR擴增結果

Fig.3 PCR amplification results of culture samples

M.DNA 標準 DL 2 000;1～6.基因組擴增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.PCR products of complete genomes

圖4 HN株全基因組PCR擴增結果

Fig.4 PCR amplification result of complete genome of HN strain

2.3 GPV非結構蛋白遺傳進化分析

利用Lasergene 7.1軟件將拼接好的HN株的非結構蛋白基因與GenBank登錄的其他鵝細小病毒非結構蛋白基因進行比較分析(表3)。從表中可知HN株與HBZF07株、82-0321株、06-0329株、B株、Y株、E株、SHFX1201株和YZ99-6株NS1基因的核苷酸同源性為99%～99.8%，推導其氨基酸的同源性為99.2%～100%。試驗株與SHFX1201的同源性最高達到99.8%，與番鴨細小病毒株FM的NS1基因同源性最低為82.7%。從圖5的HN株NS1基因的遺傳進化樹可以看出，GPV在NS1基因可以分成明顯的2個基因亞群，HN株與鵝細小病毒匈牙利株(B)、歐洲疫苗株(VG32/1)和臺灣株(82-0321V、82-0321、06-0329)均處在第I亞群，番鴨源匈牙利株FM 單獨處于第Ⅱ亞群。HN株與安徽分離株Y以及SHFX1201株同源性最接近。

圖5 HN株的NS1基因遺傳進化樹

2.4 GPV結構蛋白遺傳進化分析

通過與其他株的對比(表4)可知試驗株與82-0321株、06-0329株、Y株、E株、SHFX1201株和YZ99-6株基因的同源性為99.2%～99.7%，推導氨基酸的同源性為99.0%～99.6%，其中與SHFX1201株同源性最高，與90-0215株同源性最低。從遺傳進化樹(圖6)可以看出HN株與分離株Y株以及SHFX1201株同源性最近。且與標準株B株和E株等處于同一基因亞群，90-0215株與FM株處于單獨的一基因亞群。

表3 HN株與其他毒株的NS1基因核苷酸和推導氨基酸序列的同源性比較

Table 3 Homology comparison of nucleotide and amino acid sequences of NS1 gene of HN strain with other strains

1234567891011121314151617194.394.382.799.694.497.399.599.198.399.094.294.799.799.599.899.6298.199.881.194.399.994.294.293.794.494.399.699.494.394.194.394.2398.199.781.294.399.994.294.293.794.494.399.799.594.394.294.494.3490.889.689.682.981.282.482.982.782.982.980.981.382.782.782.982.85100.098.198.190.894.497.799.999.498.799.494.294.799.799.799.899.8698.299.899.889.898.294.394.393.894.594.499.799.594.494.294.494.3799.297.397.390.199.297.597.797.397.898.094.194.697.497.597.697.6899.897.997.990.699.898.199.099.498.799.494.194.699.699.699.799.7999.297.397.390.099.297.598.49998.398.993.694.199.299.299.399.31099.497.897.890.499.497.998.699.298.699.094.394.798.598.598.598.51199.897.997.990.699.898.199.099.799.099.294.294.899.299.299.299.21297.699.299.289.297.699.496.897.596.897.397.599.394.294.194.394.21398.499.499.490.098.499.597.698.297.698.198.698.994.794.594.794.51499.897.997.990.899.898.199.099.799.099.299.797.598.299.699.899.61599.797.897.890.499.797.998.999.598.999.099.597.398.199.599.699.716100.098.198.190.8100.098.299.299.899.299.499.897.698.499.899.799.71799.898.298.290.699.898.499.099.799.099.299.797.898.299.799.599.8

注(Note)：1.HN；2.AF416726 GPV-YG；3.AY506546 HG5/82；4.BDU22967 MDPV FM；5.EU022755 HBZF07；6.EU253479 LN-1/06；7.EU583389 82-0321V；8.EU583390 82-0321；9.EU583391 06-0329；10.EU583392 VG32/1；11.GPU25749 B；12.HQ891825 GDaGPV；13.JF333590 SH；14.KC178571 Y；15.KC184133 E；16.KC478066 SHFX1201；17.KC996730 YZ99-6.

3 討論

鵝細小病毒病是一種傳染性極強的傳染病，既能傳染鵝也能傳染番鴨，對于養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的危害，因此GPV的分離鑒定、遺傳進化分析以及疫苗的研制成為重點。目前，GPV的分離主要通過接種鵝胚、番鴨胚或鵝胚成纖維細胞進行。周彩顯等[10]通過接種10日齡鵝胚成功分離到6株GPV；邱娜等[11]通過采用不同代次的鵝胚成纖維細胞連續(xù)培養(yǎng)YN株GPV的方法，獲得了高滴度的鵝細小病毒細胞適應株，本試驗通過尿囊腔接種番鴨胚，成功分離到1株疑似GPV，通過PCR驗證為GPV，并命名為HN株。匈牙利強毒株B株、安徽Y株、中國大陸SH株、GDaGPV株在ITR區(qū)均為444 bp；歐洲VG32/1株和安徽E株都為443 bp；中國臺灣地方分離株06-0329、82-0321、82-0321V在ITR區(qū)分別為418、416、381 bp；安徽Y株和E株分別為444 bp和443 bp；HN株的ITR區(qū)與安徽Y株相同，各株NS1基因區(qū)和VP1基因區(qū)相對較穩(wěn)定。從以上目前分離到的不同毒株來看，GPV的結構的不同對其致病力是有影響的[12]，作為GPV的免疫保護抗原，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體的VP1基因具有相對較高的保守性，其常常作為GPV分子生物學診斷以及遺傳進化分析的依據(jù)[13]，這都有待于進一步的研究。

表4 HN株與其他毒株的VP1基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比較

Table 4 Homology comparison of nucleotide and amino acid sequences of VP1 gene of HN strain with other strains

1234567891011121314151617195.880.195.980.395.996.699.399.296.096.595.796.199.699.299.799.5298.079.599.679.799.793.995.595.393.593.799.899.495.895.695.795.7387.085.979.598.179.580.580.280.180.881.179.579.980.380.580.280.3498.099.285.779.799.893.995.795.593.593.799.599.295.995.795.895.8586.685.897.485.579.780.880.580.481.181.579.780.080.580.880.580.6698.199.385.899.385.793.995.795.593.593.799.699.395.995.795.895.8798.497.087.097.086.997.196.896.596.696.993.794.296.896.796.896.9899.398.187.098.186.998.298.899.696.296.695.596.099.499.399.599.6999.097.587.097.586.997.798.299.296.096.495.395.799.399.199.499.41097.596.587.496.587.396.697.797.797.898.793.493.996.396.596.396.31197.796.387.496.387.696.597.897.897.798.593.594.196.796.996.796.71297.799.785.798.985.599.096.797.897.396.296.099.495.795.595.695.61398.099.586.298.986.199.097.398.197.596.796.699.596.196.096.096.01499.698.187.298.187.098.298.899.799.598.098.197.898.199.599.899.61599.698.187.098.186.998.298.699.699.397.898.097.898.199.999.599.51699.698.187.298.187.098.298.899.799.598.098.197.898.1100.099.999.71799.398.187.098.186.898.298.599.799.297.797.897.898.199.799.699.7

注(Note)：1.HN；2.AF416726 GPV-YG；3.AY382891 90-0215；4.AY512830 GD；5.BDU22967 MDPV FM；6.EU088101 SCh；7.EU583389 82-0321V；8.EU583390 82-0321；9.EU583391 06-0329；10.EU583392 VG32/1；11.GPU25749 B ；12.HQ891825 GDaGPV；13.JF333590 SH；14.KC178571 Y；15.KC184133 E；16.KC478066 SHFX1201；17.KC996730 YZ99-6.

圖6 HN株的VP1基因遺傳進化樹

本研究通過將GPV HN株與GenBank上的各GPV的非結構蛋白和結構蛋白相對比，發(fā)現(xiàn)NS1基因和VP1基因的遺傳較穩(wěn)定[14]，但是HN株與兩株國內(nèi)南方分離株Y株和SHFX1201株同源性最高并且屬于同基因亞群，造成這一現(xiàn)象的原因可能是近年來養(yǎng)鵝業(yè)和養(yǎng)鴨業(yè)的不斷擴大，海南省從南方各地區(qū)引進鵝苗和番鴨苗，導致鵝群和番鴨群攜帶的GPV進入海南省而出現(xiàn)毒株同源性高。

海南省從20世紀70年代以來，在?？?、三亞、保亭、昌江、陵水、澄邁、儋州等地先后有鵝細小病毒流行的報道，但是對鵝細小病毒的研究只是局限在診斷、防控與部分基因片段的研究，王德富等[15]對海南地區(qū)的小鵝瘟病做了診斷與防控的相關報道；曹宗喜等[16]對海南分離的3株鵝細小病毒VP3基因進行了分析。本文首次對鵝細小病毒海南分離株進行全基因組分析，豐富了我國鵝細小病毒基因組數(shù)據(jù)資料，可為海南省鵝細小病毒的防控提供理論依據(jù)。

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Isolation，Identification and Complete Genomic Sequence Analysis of Goose Parvovirus HN Strain

HE Dong-mei1,2,TAN Shu-yi1,CHEN Chao-xi2,YE Bao-guo1,ZHANG Yan1,LIN Zhe-min1,CAO Zong-xi1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,HainanAcademyofAgriculturalSciences,Haikou,Hainan,571100,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China)

To investigate the variation status of goose parvovirus,the samples(liver,spleen and so on) of suspected GPV infection were collected from a goose farm of Hainan province.A virus strain was isolated by inoculation of goose embryo after treatment,and named as HN strain after PCR. The complete genomic sequence was obtained,and compared with the sequences of sixteen strains of goose parvoviruses and Muscovy duck parvovirus in GenBank.The results showed that the full-genome contains the inverted terminal repeat (ITR) and two major open reading frames (ORF).ITR at the 5′ and 3′ ends of the genome has 444 nucleotides (nt). The left ORF contains 1884 nts in length,the right ORF contains 1 884 nts in length. The nucleotide sequences of HN strain showed the highest homology with NS1 gene and VP1 gene of SHFX1201 strain,with 99.8% and 99.7%,respectively.And the homologies with the NS1 gene of FM strain and VP1 gene of 90-0215 strain were lower,with 82.7% and 80.1%,respectively.Phylogenetic tree of HN strains demonstrated that GPV can be obviously divided into two gene subsets.HN strain and B strain from Hungary and VG32/1 strain from European are located in the subgroup I,and the high homology with Y strain isolated from Anhui and SHFX1201 strain,the Muscovy duck parvovirus of FM strain isolated from Hungary located in the subgroup II.This study provided a basis for the study of the relationship between GPV classification status and genetic evolution,and laid the foundation for the study of GPV epidemic trends and vaccine development.

Goose parvovirus; isolation and identification;complete genome; IRT; NS1; VP1

2016-05-23

海南省屬科研院所技術開發(fā)研究專項(KYYS-2015-13);海南省自然科學基金項目(20153085);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金項目(CARS-43)

賀冬梅(1988-)，女，四川簡陽人，碩士研究生，主要從事動物病毒學研究。*通訊作者

S852.659.2

A

1007-5038(2016)12-0013-06