苦參堿對胃癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

趙美蘭，宋良權(quán)，夏忠民，趙雪峰

(1.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116021; 2. 大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

論 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.06

苦參堿對胃癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

趙美蘭1，宋良權(quán)1，夏忠民1，趙雪峰2

(1.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116021; 2. 大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

目的 建立穩(wěn)定的裸鼠胃癌模型，觀察苦參堿的抗腫瘤作用。方法 將20只胃癌模型裸鼠隨機(jī)分為4組，分別為對照組、高濃度苦參堿(100 mg/ kg·d-1, HM)組、低濃度苦參堿(50 mg/ kg·d-1, LM)組、環(huán)磷酰胺(20 mg/ kg·d-1, CTX)組。測定各組胃癌成瘤和區(qū)域淋巴結(jié)腫大情況，并采用病理學(xué)檢查來明確有無癌腫浸潤生長及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)果 建立裸鼠胃癌模型的成功率為100%。大體樣本觀察發(fā)現(xiàn)，HM組、LM組和CTX組胃癌成瘤腫物大小明顯小于對照組；并無明顯的區(qū)域淋巴結(jié)腫大；差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HM組無腹腔內(nèi)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無癌腫浸潤生長，與CTX組無明顯差異，但與對照組相比差異有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論 苦參堿有良好的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性；苦參堿對人胃癌潛在抑制作用提供理論基礎(chǔ)。

苦參堿；胃癌；裸鼠；抗腫瘤

胃癌是全世界常見的消化道惡性腫瘤，在中國發(fā)病率和死亡率很高[1]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌治療效果中最重要的因素之一，也是反映疾病進(jìn)程和評估患者預(yù)后的依據(jù)[2]?？鄥A(Matrine)是從我國中藥苦參中提取的一種藥效成分，具有廣泛的藥理作用，而近期研究發(fā)現(xiàn)其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移等作用[3]。本課題采用穩(wěn)定的胃癌模型，研究苦參堿對胃癌抑制作用的影響。

1 材料和方法

1.1 材 料

苦參堿購于寶雞永嘉天然植物開發(fā)有限公司；人胃癌細(xì)胞株MKN-45由大連大學(xué)分子生物學(xué)教研室傳代捐助；BALb/c品系裸鼠20只，7周齡雌性，體重18～20 g，從大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心購買。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤細(xì)胞懸液制備：人胃癌細(xì)胞株MKN-45在37 ℃、5% CO2，含10% 小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，每2～3 d換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至80%～90% 融合時，用0.25% 胰酶消化液消化后，1000 r/min離心3 min，棄上清液，加無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，顯微鏡下計數(shù)。制備好的細(xì)胞懸液防冰浴保存，于30 min內(nèi)進(jìn)行接種。

1.2.2 建立胃癌模型的步驟[4]：根據(jù)麻醉預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取5%水合氯醛 5 mg/kg行腹腔內(nèi)麻醉。常規(guī)消毒皮膚，取上腹正中切口約0.5 cm，入腹后小心顯露胃，把胃牽出切口外，將33號針頭選擇胃竇部與胃體部交匯處靠大彎側(cè)迷路進(jìn)針約3 mm緩慢注入5×106MKN-45癌細(xì)胞懸液50 μL至黏膜下層與肌層之間(注入時感輕度落空感)。可見注射部位有輕度隆起，并可觀察到隆起處胃壁顏色略微變淺。拔出針頭的同時即用消毒棉簽輕輕按壓約5 s，將胃輕柔送回腹腔內(nèi)后，逐層關(guān)腹。

1.2.3 動物模型設(shè)計： 動物模型建立前1周將實(shí)驗(yàn)動物處于安靜狀態(tài)，防止一切刺激性操作。成功建立胃癌模型后第3天，將共20只裸鼠隨機(jī)分4組，分別為5只對照組、5只高濃度苦參堿(100 mg/kg·d-1, HM)組、5只低濃度苦參堿(50 mg/ kg·d-1, LM)組、5只環(huán)磷酰胺(20 mg/ kg·d-1, CTX)組。注藥方式為腹腔內(nèi)注射，每日1次，注射體積為200 μL，連續(xù)注射4周；同上述方法，對照組注入生理鹽水200 μL。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)：每天常規(guī)觀察并記錄裸鼠狀態(tài)，模型建立30 d后將各組裸鼠給予脫頸處死。首先解剖觀察胃腫物直徑大小、質(zhì)地、區(qū)域淋巴結(jié)腫大情況，其次觀察腹膜種植轉(zhuǎn)移、血性腹水及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，同時觀察胸腔內(nèi)、顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤情況。所有肉眼可疑部位照相并取材，行病理學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 建立裸鼠胃癌模型的安全性和可靠性

建立裸鼠胃癌模型后連續(xù)觀察3 d，發(fā)現(xiàn)其裸鼠狀態(tài)良好，無一例手術(shù)操作死亡；表明此項(xiàng)操作技術(shù)安全、可靠。模型建立30 d后解剖觀察各組，發(fā)現(xiàn)無參差不齊的結(jié)果，并其結(jié)果相對穩(wěn)定；表明此模型的建立具有相對穩(wěn)定性。

2.2 苦參堿對裸鼠胃癌模型的抗腫瘤作用

大體標(biāo)本觀察中，發(fā)現(xiàn)HM組、LM組及CTX組胃癌成瘤腫瘤大小明顯小于對照組，腫瘤質(zhì)地明顯變軟或觸摸不清，也無明顯的區(qū)域淋巴結(jié)腫大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1A-B、圖1E-F。鏡下發(fā)現(xiàn)，HM組、LM組及CTX組的胃癌成瘤腫物大小、區(qū)域淋巴結(jié)腫大及轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯小于對照組；HM組和CTX組無明顯癌腫浸潤生長并無明顯系統(tǒng)內(nèi)區(qū)域淋巴結(jié)腫大及轉(zhuǎn)移，與對照組和LM組相比有顯著差異(P<0.05)。見圖1C-D、圖1G-H及表1。

圖1 對照組和HM組腫瘤大小和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的大體標(biāo)本及病理學(xué)觀察結(jié)果 (代表性圖片) Fig 1 Tumor size and lymph node metastasis of gross evaluation and pathological identification in control and high-density Matrine group (Representative picture)A-B:對照組腫瘤大小和區(qū)域淋巴結(jié)腫大的大體標(biāo)本； C-D:對照組癌腫浸潤生長和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯微鏡下表現(xiàn)；E-F:HM組腫瘤大小和區(qū)域淋巴結(jié)腫大的大體標(biāo)本；G-H:HM組癌腫浸潤生長和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯微鏡下表現(xiàn)

表1 鏡下各組腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)腫大及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較

1)與對照組相比，P<0.05；2)與LM組比較，P<0.05

3 討 論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的重要方式之一，也是新生淋巴管、趨化因子及其受體勾起的“導(dǎo)向”作用之一[5]。研究證實(shí)，即便是早期胃癌階段，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，且是選擇治療方案的參考要素[6]。胃癌術(shù)中盡管以潛在性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)實(shí)施淋巴結(jié)清掃，也避免不了腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。進(jìn)展期胃癌不僅以外科手術(shù)為主要治療方法，迫切需要尋求更多的輔助治療手段來提高其療效。

苦參堿是豆科植物苦參的根、莖、果來提取和精煉的生物堿，近期對其藥理作用和臨床研究證實(shí)具有抗腫瘤活性，并發(fā)現(xiàn)其腫瘤抑制作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HM組和LM組與對照組相比腫瘤大小、腫瘤質(zhì)地、區(qū)域淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移等指標(biāo)明顯優(yōu)于對照組；表明苦參堿可抑制胃癌細(xì)胞生長或胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，苦參堿對細(xì)胞的毒性作用低，而更適合對其抗腫瘤潛能的研究[9]。雖然CTX是臨床常用的化療藥物，且抗腫瘤療效滿意，但在實(shí)驗(yàn)動物或臨床應(yīng)用中毒副作用顯著[10]。在我們研究過程中，發(fā)現(xiàn)CTX組與HM組的最終抗腫瘤療效類似，但CTX組裸鼠曾出現(xiàn)過活動相對遲緩、皮膚粗糙及進(jìn)食不佳等毒副作用。

目前對苦參堿的抗腫瘤療效研究仍處于初級階段，且缺乏對其系統(tǒng)的評價和深入的機(jī)制研究[11]。雖然諸多研究中獲取苦參堿貌似療效佳、毒副作用小的抗腫瘤藥物，但需要更佳完善的數(shù)據(jù)來進(jìn)一步驗(yàn)證苦參堿的藥理作用和抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移機(jī)制[12]。

綜上所述，苦參堿可能通過不同的途徑發(fā)揮其抗腫瘤的作用。我們通過動物模型，證實(shí)了苦參堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性，且苦參堿對人胃癌潛在抑制作用提供理論基礎(chǔ)，但苦參堿的抗腫作用機(jī)制有待于進(jìn)一步評價和證實(shí)。

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Anti-tumor effect of Matrine in the gastric cancer nude mice model

ZHAO Mei-lan1, SONG Liang-quan1, XIA Zhong-min1, ZHAO Xue-feng2

(1.DepartmentofPharmacy, 2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedXinhuaHospitalofDalianUniversity,Dalian116021,China)

Objective To observe the anti-tumor effect of Matrine in human gastric cancer nude mice model. Method Twenty gastric cancer nude mice models were randomized into four groups, high-dose Matrine (100 mg/kg·d-1) group, low-dose Matrine (50 mg/kg·d-1) group, cyclophosphamide (CTX) group and control group. The tumor formation and lymphadenectasis were evaluated. The tumor cell infiltration growth and lymph node metastasis were examined in histopathological methods. Results Tumor formation were observed in all human gastric cancer nude mice models. Compared with control group, the high-dose， low-dose Matrine and CTX groups had a significantly less gastric tumor size and no obvious lymphadenectasis (P<0.05). And there was no tumor cell infiltration growth and lymph node metastasis in high-dose Matrine group. There was no significant difference in tumor size, tumor cell infiltration growth, and lymph node metastasis between CTX group and the high-dose Matrine group (P>0.05). Conclusion Matrine could play a role in gastric cancer treatment with it anti-tumor effect.

Matrine; gastric cancer; nude mice; anti-tumor

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201602037)；大連大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目(20151QL019)

趙美蘭(1976-)，女，吉林延邊人，主管藥師。E-mail:2216258048@qq.com

趙雪峰，副教授。E-mail:zhaoxuefeng74@hanmail.net

R932

A

1671-7295(2016)06-0546-03

趙美蘭，宋良權(quán)，夏忠民,等.苦參堿對胃癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016,38(6)：546-548.

2016-08-28;

2016-11-06)