蓯蓉精對(duì)MPP+誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷后GSK-3β表達(dá)的影響

覃威 葉水芬 范雯 魏維 許茜 蔡晶

蓯蓉精對(duì)MPP+誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷后GSK-3β表達(dá)的影響

覃威 葉水芬 范雯 魏維 許茜 蔡晶

目的 觀察蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)損傷的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞MES23.5細(xì)胞中帕金森病相關(guān)蛋白α-突觸核蛋白(α-synuclein)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Tau蛋白表達(dá)的影響，探討蓯蓉精治療帕金森病的作用機(jī)制。方法 分別將蓯蓉精水提物及納米微粉經(jīng)PBS溶解后加入培養(yǎng)基使終濃度為100、200、250 μg/mL，孵育MPP+誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞24 h后，并設(shè)模型對(duì)照(MPP+誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞，不加干預(yù))及空白對(duì)照組(未經(jīng)任何處理的MES23.5細(xì)胞)，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，Western Blot法測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)α-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白表達(dá)。結(jié)果 同空白對(duì)照組比較，模型組及蓯蓉精水提物及納米微粉100、200、250 μg/mL組α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均升高(分別P<0.01、P<0.05)；與模型組比較，蓯蓉精水提物及納米微粉100、200、250 μg/mL組α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均顯著降低(分別P<0.01、P<0.05)。除蓯蓉精納米微粉100 μg/mL組GSK-3β磷酸化水平與蓯蓉精水提物100 μg/mL組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各蓯蓉精納米微粉組α-synuclein、GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平均低于相同濃度的蓯蓉精水提物組(分別P<0.01、P<0.05)。結(jié)論 蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉均能夠減輕MPP+誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞的損傷，且蓯蓉精納米微粉的效果相對(duì)較好。其機(jī)制可能與蓯蓉精可以減少α-synuclein的聚集，降低GSK-3β的活性，抑制Tau蛋白的過度磷酸化有關(guān)。

蓯蓉精水提物；蓯蓉精納米微粉；帕金森?。籑ES23.5細(xì)胞；神經(jīng)保護(hù)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是以黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性壞死、多巴胺遞質(zhì)缺乏為主要病理基礎(chǔ)的常見老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)帕金森相關(guān)蛋白α-突觸核蛋白(α-synuclein)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、Tau蛋白對(duì)于PD的發(fā)病和發(fā)展以及多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)具有重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]。本課題組前期研究表明蓯蓉精水提物能夠通過調(diào)控神經(jīng)凋亡因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，抑制多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[4]。本文以多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞MES23.5細(xì)胞為研究對(duì)象，用1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridinium，MPP+)誘導(dǎo)建立PD的體外細(xì)胞損傷模型，觀察蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉對(duì)MPP+損傷的MES23.5細(xì)胞的存活率以及PD相關(guān)蛋白α-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白表達(dá)的影響，并初步探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，以期為防治PD提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 MES23.5多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞系首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室陳彪教授贈(zèng)送。蓯蓉精方(由肉蓯蓉10 g，淫羊藿10 g，黃精18 g三味中藥組成，購于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院)，MPP+、4-甲基耦氮唑藍(lán)(MTT)、谷氨酰胺為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；α-synuclein、GSK3β、Tau蛋白、磷酸化的Tau蛋白(Phospho-Tau)、磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(Phospho-GSK3β)等抗體均購自于美國的cell signaling Technolegy公司。ELX800酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraeus)，Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀、電泳槽(美國 Bio-Rad公司)，DU-650型蛋白分析儀(美國 Beckman公司)，5417R高速冷凍離心機(jī)(德國 Eppendorf公司)，SXQM型雙行星式球磨機(jī)(長沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司)，混合球磨儀(Retsch MM400，德國)。

1.2 方法

1.2.1 蓯蓉精水提物的制備：精確稱取蓯蓉精中藥材(肉蓯蓉10 g，淫羊藿10 g，黃精18 g)，并進(jìn)行傳統(tǒng)凈化、干燥；將藥品混勻粉碎，浸泡于藥材體積10倍的超純水中1 h，加熱回流2 h，紗網(wǎng)過濾，收集第一次蓯蓉精水提液，再加入藥材體積10倍的蒸餾水，加熱回流2 h，過濾收集第二次蓯蓉精水提液，合并兩次液體，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮藥。濾液濃縮為浸膏，-20℃保存。使用時(shí)將蓯蓉精浸膏用PBS溶解配成25 mg/mL母液，超聲波震蕩儀超聲震蕩30 min促進(jìn)浸膏的溶解，高壓滅菌，-20℃保存待用。

1.2.2 蓯蓉精納米微粉的制備：精確稱取蓯蓉精中藥材(肉蓯蓉10 g，淫羊藿10 g，黃精18 g)，并進(jìn)行傳統(tǒng)凈化、干燥；將凈化干燥的蓯蓉精中藥材進(jìn)行常規(guī)粉碎，要求達(dá)到可通過200目篩的細(xì)粉；將蓯蓉精細(xì)粉經(jīng)進(jìn)一步的冷凍干燥后，采用溫度可控真空高能球磨法制備蓯蓉精納米微粉。具體步驟是：原料蓯蓉精細(xì)粉置于配有深冷外套的真空球磨罐中，同時(shí)裝入硬質(zhì)合金磨球，使球與蓯蓉精細(xì)粉的體積比保持在15︰1～5︰1范圍，高能球磨機(jī)以轉(zhuǎn)速300 r/min磨制20 min，得到微粉，稱取適量微粉進(jìn)行納米級(jí)材料加工。將上述研磨粉末于混合球磨儀中加工，以25次/s振蕩20 s，重復(fù)3次。使用時(shí)用PBS將蓯蓉精納米微粉溶解配成25 mg/mL母液，超聲30 min，高壓滅菌，-20℃保存待用。

1.2.3 體外PD模型細(xì)胞的建立：MES23.5細(xì)胞接種于含5%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(質(zhì)量濃度)谷氨酰胺、2%(質(zhì)量濃度)50×Sato’s溶液和2%(體積分?jǐn)?shù))青/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%(質(zhì)量濃度)胰酶消化傳代，收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以細(xì)胞密度1×105接種到96孔板中，加入終濃度為100 μmol/L的MPP+培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，建立體外PD模型細(xì)胞。

1.2.4 選取適宜的蓯蓉精水提物和納米微粉的干預(yù)濃度及干預(yù)時(shí)間：取上述PD模型細(xì)胞，分別加入終濃度為10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL的蓯蓉精水提物和蓯蓉精納米微粉培養(yǎng)液，作為藥物干預(yù)組；未加藥物的細(xì)胞為模型對(duì)照組；未加MPP+以及未加藥物的正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的MES23.5細(xì)胞為空白對(duì)照組，每個(gè)組別均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h和48 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，步驟如下：向96孔板中加入5 mg/mL的MTT，37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，加入150 μL的DMSO，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上選擇490 mm的波長，檢測(cè)各個(gè)孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組吸光度均值/空白對(duì)照組吸光度均值×100%。選取各蓯蓉精水提物和納米微粉組中細(xì)胞存活率最高三組的濃度、最短時(shí)間進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western Blot法測(cè)定帕金森病相關(guān)蛋白α-synuclein、GSK-3β、Tau：取體外PD模型細(xì)胞，按上述預(yù)實(shí)驗(yàn)中選擇的蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉濃度及時(shí)間進(jìn)行干預(yù)。然后收集細(xì)胞，向上述細(xì)胞加入含有RIPA、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的混合裂解液冰上裂解30 min，收集細(xì)胞碎片和裂解液于4℃下12000 r/min離心5 min，取上清，提取蛋白，按照同樣的方法重復(fù)提取蛋白3次。BCA蛋白定量；SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入α-synuclein單克隆抗體(1︰1000)、GSK-3β單克隆抗體(1︰1000)、Phospho-GSK3β單克隆抗體(1︰800)、Tau單克隆抗體(1︰1000)、Phospho-Tau單克隆抗體(1︰800)、β-actin單克隆抗體(1︰1000)， 4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1︰5000)反應(yīng)1 h；膜上加ECL顯影劑，反應(yīng)2 min，常規(guī)顯影，用Image Lab軟件對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，分別計(jì)算目標(biāo)蛋白與β-actin、P-GSK-3β與GSK-3β、P-Tau與Tau蛋白的灰度值比。目標(biāo)蛋白與β-actin的比值表示各個(gè)目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，P-GSK-3β與GSK-3β的比值表示GSK-3β的磷酸化水平，P-Tau與Tau蛋白的比值表示Tau蛋白磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x2±s)表示。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD法；方差不齊則采用Games-Howell法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物干預(yù)的濃度和時(shí)間的選擇 結(jié)果見表1、表2。與空白對(duì)照組比較，模型組及各蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉組細(xì)胞存活率顯著降低(均P<0.01)；與模型組比較，各蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉組細(xì)胞存活率均有一定程度的升高(均P<0.01)，而且蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉100、200、250 μg/mL組的細(xì)胞存活率均高于其他濃度組及模型組(均P<0.01)。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇濃度為100、200、250 μg/mL蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉干預(yù)24 h作為干預(yù)條件。

表1 各組MPP+誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞存活率比較(n=6，%，±s)

注：與空白對(duì)照組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與水提物 10組比較：ΔP<0.01；與水提物50組比較：○P<0.05，○○P<0.01；與水提物 100組比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01；與水提物 200組比較，▲P<0.01；與水提物 250組比較，▼P<0.01；與水提物 500組比較，★P<0.05；水提物10、50、100、200、250、500、1000分別表示蓯蓉精水提物濃度為10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL

表2 不同濃度蓯蓉精納米微粉對(duì)MPP+誘導(dǎo)MES23.5細(xì)胞損傷后細(xì)胞存活率的影響(n=6，%，±s)

注：與空白對(duì)照組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.01；與納米微粉 10組比較：ΔP<0.01；與納米微粉50組比較：○P<0.05，○○P<0.01；與納米微粉 100組比較：☆P<0.01；與納米微粉 200組比較，▲P<0.01；與納米微粉 250組比較，▼P<0.01；與納米微粉 500組比較，★P<0.05；水提物10、50、100、200、250、500、1000分別表示蓯蓉精納米微粉濃度為10、50、100、200、250、500、1000 μg/mL

2.2 各蓯蓉精水提物組各及蓯蓉精納米微粉組帕金森病相關(guān)蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，模型組α-synuclein蛋白表達(dá)量及GSK-3β蛋白和Tau蛋白的磷酸化水平均顯著升高(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，各蓯蓉精水提物組及各蓯蓉精納米微粉組α-synuclein蛋白表達(dá)量、GSK-3β蛋白和Tau蛋白的磷酸化水平降低(P<0.01或P<0.05)；蓯蓉精納米微粉100、200、250 μg/mL組α-synuclein蛋白表達(dá)量、Tau蛋白磷酸化水平均低于同濃度蓯蓉精水提物組(均P<0.01)；蓯蓉精納米微粉200、250 μg/mL組GSK-3β蛋白的磷酸化水平亦低于同濃度蓯蓉精水提物組(均P<0.01)，但蓯蓉精納米微粉100 μg/mL與蓉精水提物100 μg/mL組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體見圖1、表3。

3 討論

注：1表示空白對(duì)照組；2表示模型組；3、4、5分別表示蓯蓉精水提物濃度為100、200、250 μg/mL，6、7、8分別表示蓯蓉精納米微粉濃度為100、200、250 μg/mL 圖1 蓯蓉精水提物及納米微粉干預(yù)后MES23.5細(xì)胞中a-synuclein、GSK-3β、Tau蛋白的表達(dá)及磷酸化水平

PD是一種慢性、進(jìn)展性的、多因素的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂性疾病，病理過程包括炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)失衡、細(xì)胞凋亡等[1]。PD的治療方法主要包括口服左旋多巴、多巴胺受體激動(dòng)劑和B型單胺氧化酶抑制劑，外科手術(shù)植入電極深部刺激丘腦底核和蒼白球，或?qū)⑸窠?jīng)干細(xì)胞移植到紋狀體。近年來，神經(jīng)干細(xì)胞用于PD的治療逐漸受到重視[5]。本文將在以往的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討補(bǔ)腎復(fù)方蓯蓉精對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

MES23.5細(xì)胞是一種雜交瘤性多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系，是由大鼠的胚胎中腦細(xì)胞與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤一膠質(zhì)瘤細(xì)胞系N18TG2雜交而成，可替代原代培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元用于研究神經(jīng)變性疾病PD[6]。本文采用MPP+誘導(dǎo)MES23.5細(xì)胞建立體外PD模型，為研究蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)的機(jī)制提供了良好的載體。

中藥可以通過各種機(jī)制發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用，包括抗氧化、抗炎、清除自由基、抗凋亡等[7]。本研究中所用蓯蓉精水提物及其納米微粉制劑是由肉蓯蓉、淫羊藿、制黃精組成的復(fù)方補(bǔ)腎制劑。中藥納米制劑由于其特有的理化性質(zhì)，具有細(xì)胞破壁率高、有效物質(zhì)溶出率高的優(yōu)點(diǎn)，可提高生物利用度，增加藥物對(duì)血腦屏障或生物膜的通透性，增強(qiáng)藥物靶向性，從而降低給藥劑量，提高藥效[8]。本實(shí)驗(yàn)中采用蓯蓉精水提物和納米微粉對(duì)MPP+誘導(dǎo)損傷的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞MES23.5進(jìn)行干預(yù)，同模型組相比各濃度的蓯蓉精水提物組及蓯蓉精納米微粉組細(xì)胞存活率均有一定程度的的升高，其中以100、200、250 μg/mL三組升高最為顯著。表明時(shí)當(dāng)蓯蓉精濃度超過250 μg/mL時(shí)，細(xì)胞毒性增強(qiáng)。因此，選擇濃度為100、200、250 μg/mL蓯蓉精水提物及蓯蓉精納米微粉干預(yù)24 h作為干預(yù)條件。上述結(jié)果也提示在未來研究中藥的神經(jīng)保護(hù)作用的同時(shí)也應(yīng)該注重毒理學(xué)研究，充分考慮毒性作用給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來的影響。

表3 各蓯蓉精水提物組及各蓯蓉精納米微粉組目的蛋白表達(dá)量及磷酸化水平比較(n=3，±s)

注：與空白對(duì)照組比較：*P<0.05, **P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與水提物100比較：ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；與水提物200比較：○P<0.05，○○P<0.01；與水提物250比較：☆P<0.01；水提物100、200、250分別表示蓯蓉精水提物濃度100、200、250 μg/mL，納米微粉100、200、250分別表示蓯蓉精納米微粉的濃度為100、200、250 μg/mL

α-synuclein是由140個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，正常生理狀況下能形成穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)。PD患者α-synuclein的突變可破壞α螺旋結(jié)構(gòu)，使之形成β折疊，進(jìn)而聚集并產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性作用的寡聚體，最終導(dǎo)致神經(jīng)變性[9]。Tau蛋白是神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)的微管相關(guān)蛋白，其生物學(xué)功能是促進(jìn)微管形成和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的作用，參與神經(jīng)元的生長發(fā)育，維持軸突的形態(tài)。Tau的過度磷酸化與細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂有重要的聯(lián)系[10]。糖元合成酶激酶3β(GSK-3β)是GSK-3兩種形式中較小的蛋白，是一段具有482個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為47 000，其結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)中心蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域。GSK-3β是最重要的催化Tau蛋白磷酸化的蛋白激酶之一，它可催化Tau蛋白上多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸位點(diǎn)的磷酸化。GSK-3β活性表達(dá)增加，可以使Tau蛋白的磷酸化增強(qiáng)[11]。進(jìn)一步的研究表明α-synuclein和Tau兩者之間存在著密切的聯(lián)系。α-synuclein蓄積很可能誘發(fā)了GSK-3β的活性，進(jìn)而促進(jìn)Tau蛋白的磷酸化水平的增加，α-synuclein充當(dāng)調(diào)節(jié)Tau蛋白和GSK-3β的連接，引導(dǎo)GSK-3β對(duì)Tau蛋白磷酸化[12]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，采用MPP+誘導(dǎo)MES23.5細(xì)胞損傷，建立體外PD模型細(xì)胞，然后通過蓯蓉精水提物或蓯蓉精納米微粉干預(yù)后，細(xì)胞的存活率相對(duì)于模型組有顯著的上升，模型組細(xì)胞內(nèi)的α-synuclein以及磷酸化的GSK-3β、Tau蛋白的表達(dá)量均明顯增高；而通過蓯蓉精水提物或蓯蓉精納米微粉干預(yù)后，α-synuclein以及磷酸化的GSK-3β、Tau蛋白的表達(dá)量均明顯降低，且蓯蓉精納米微粉的效果更好，其可能機(jī)制為蓯蓉精水提物或蓯蓉精納米微粉干預(yù)模型組細(xì)胞后，α-synuclein的聚集減少，抑制了GSK-3β的活性，從而抑制了Tau蛋白的過度磷酸化，提高了細(xì)胞的存活率，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在神經(jīng)保護(hù)以及PD的防治方面，蓯蓉精納米微粉較蓯蓉精水提物具有較好的效果，為帕金森的防治提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)的不足之處是對(duì)高濃度藥物配方的毒理作用沒有進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。中藥的毒性對(duì)藥物的治療干預(yù)效果可能有一定的拮抗作用，因此未來應(yīng)進(jìn)行更深入的探索，以更好的發(fā)揮中藥的優(yōu)勢(shì)。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Effects of Congrongjing on the expression of GSK-3β protein after the injury of dopaminergic neurons induced by MPP+

QINWei，YEShuifen，F(xiàn)ANWen，WEIWei，XUQian，CAIJing*.

*DepartmentofNeurology，CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，F(xiàn)ujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhouFujian350122，China

Corresponding author：CAI Jing，Email：caij1@163.com

Objective To observe the effect of Congrongjing aqueous extract and Congrongjingnano-powders on the expression of Parkinson’s disease(PD)associated proteins,α-synuclein，GSK-3βand Tau in injured dopaminergic neurons induced by 1-methyl-4-phenyl-pyridinium(MPP+)and investigate the mechanism of Congrongjing in the treatment of PD. Methods Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders dissolved by PBS medium were added into the culture medium and different concentrations of solution(100，200，250 μg/mL)were prepared. Then the PD model cells induced by MPP+were cultured by the above culture medium for 24 h，model control group(PD model cells were induced by MPP+，without intervention)and blank control group(MES23.5 cells without any treatment)were set up，MTT method was used to detect the cell survival rate，changes in expression of a-synuclein，GSK-3β and Tau protein in cells were determined by Western blot. Results Compared with the blank control group，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein increased in the model control group，Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders 100，200，250 μg/mL groups(P<0.01，P<0.05，respectively).Compared with the model control group，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein decreased in the Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders 100，200，250 μg/mL groups (P<0.01，P<0.05，respectively).Except for the phosphorylation level of GSK-3β protein between the Congrongjing aqueous extract 100 μg/mL groupand the Congrongjin gnano-powders 100 μg/mL group(P>0.05)，the expression levels of α-synuclein protein，phosphorylation level of GSK-3β protein and Tau protein of Congrongjing nano-powders groups were significantly lower than those of the Congrongjing aqueous extract group(P<0.01，P<0.05，respectively).Conclusions Congrongjing aqueous extract and Congrongjing nano-powders can reduce the injury of MES23.5 cells induced by MPP+and the effect of Congrongjing nano-powders is better. The mechanism may be related to reducing the accumulation of the α-synuclein and theactivity of GSK-3β, inhibiting the excessive phosphorylation of Tau protein.

Congrongjing aqueous extract；congrongjing nano-powders；Parkinson's disease；MES23.5 cells；neuroprotective

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.06.007

國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金項(xiàng)目(WKJ-FJ-38)；福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015J01686)；校管重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)資助(X2014010-學(xué)科)

350122 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院(覃威)；364000福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院老年病科(葉水芬)；361026 廈門市海滄醫(yī)院綜合內(nèi)科(范雯)；441003湖北省襄陽市第四七七醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(魏維)；350122 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院(許茜、蔡晶)

蔡晶，Email：caij1@163.com

R742.5

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1006-2963(2016)06-0415-06

2015-11-06)