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    銀杏葉中銀杏內(nèi)酯提取工藝研究

    2017-01-03 06:27:49李文東高乾善楊鵬楊丙田王曉
    山東科學(xué) 2016年5期
    關(guān)鍵詞:銀杏葉內(nèi)酯銀杏

    李文東, 高乾善,楊鵬 ,楊丙田,王曉*

    (1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018; 2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省分析測(cè)試中心,山東 濟(jì)南 250014;3. 濟(jì)南森康三峰生物工程有限公司,山東 濟(jì)南 250014)

    ?

    【中藥與天然活性產(chǎn)物】

    銀杏葉中銀杏內(nèi)酯提取工藝研究

    李文東1,2, 高乾善2,楊鵬3,楊丙田3,王曉2*

    (1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018; 2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省分析測(cè)試中心,山東 濟(jì)南 250014;3. 濟(jì)南森康三峰生物工程有限公司,山東 濟(jì)南 250014)

    以銀杏內(nèi)酯(白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C)的提取率為指標(biāo),確定銀杏葉乙醇提取的最佳提取工藝。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法,系統(tǒng)考察提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)4個(gè)因素對(duì)銀杏葉提取工藝的影響。以異丙醇為流動(dòng)相,優(yōu)化高效液相色譜法(HPLC-ELSD)測(cè)定銀杏內(nèi)酯的含量,并計(jì)算提取率。實(shí)驗(yàn)得出最佳提取工藝條件為提取時(shí)間1.5 h、料液比1:20、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取次數(shù)3次。本工藝可以提高銀杏內(nèi)酯的提取率,節(jié)約試驗(yàn)成本,適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

    銀杏葉;銀杏內(nèi)酯;正交試驗(yàn);提取率;異丙醇

    銀杏(GinkgobilobaL.)又名白果、公孫樹、鴨腳子或鴨掌樹,是銀杏科銀杏屬中唯一的生存種屬,被譽(yù)為“活化石”。我國自古以來就有銀杏葉入藥和食療的記載,如《本草品匯精要》中提到,銀杏葉“歸肺經(jīng),能斂肺平喘,益心止痛”。20世紀(jì)70年代銀杏葉提取物(extract ofGinkgobiloba, EGb)治療中樞外周血流紊亂和腦血管動(dòng)脈粥樣硬化的報(bào)導(dǎo)出現(xiàn),其藥用價(jià)值受到了更為廣泛的關(guān)注[1-2]。

    銀杏葉的化學(xué)成分復(fù)雜,已有報(bào)導(dǎo)的成分多達(dá)180種[3],其中主要活性成分為萜類內(nèi)酯化合物(ginkgolides and bilobalides)和黃酮類化合物(flavonoid glycosides)[4]。銀杏內(nèi)酯(ginkgolide)是二萜內(nèi)酯,萜類內(nèi)酯類化合物包括銀杏內(nèi)酯 A、B、C、J 和 M等,均為血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)拮抗劑[5],可在臨床上用于治療血栓、急性胰腺炎和心血管疾病[6]。白果內(nèi)酯(bilobalide)分子中含有15個(gè)碳原子,屬于倍半萜類化合物,具有保護(hù)神經(jīng)的作用,對(duì)老年癡呆的治療具有良好的效果[7]。目前,從銀杏葉中已分離得到8個(gè)萜類內(nèi)酯化合物:銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M、K、L 和白果內(nèi)酯[8-9]。銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。銀杏內(nèi)酯的分子立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,化學(xué)合成和植物組織培養(yǎng)均受到技術(shù)難度大、生產(chǎn)成本高等因素制約,所以銀杏內(nèi)酯來源以提取銀杏葉為主[10]。在以往的研究中都考慮到銀杏黃酮的提取率,只把銀杏內(nèi)酯作為附帶產(chǎn)品提取,未對(duì)銀杏內(nèi)酯提取率影響因素做有針對(duì)性的研究[11-13]。在檢測(cè)方法方面銀杏內(nèi)酯目前采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定,所用流動(dòng)相為甲醇-四氫呋喃-水系統(tǒng),其中四氫呋喃在分析過程中存在價(jià)格高、易揮發(fā)和對(duì)人有害等缺點(diǎn)[14-17]。本研究確定了從銀杏葉中提取銀杏內(nèi)酯工藝的最佳參數(shù),提高了銀杏內(nèi)酯的提取效率,同時(shí)優(yōu)化的檢測(cè)方法使銀杏內(nèi)酯測(cè)定更加方便快捷。

    圖1 銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of ginkgolides and ginkgo lactone

    1 儀器與試劑

    KT-300Y型超聲波藥品處理機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Agilent 1260與385-ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國安捷倫科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);KDM型可控調(diào)溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)。銀杏葉(山東雙花制藥有限公司)。銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(上海生化試劑廠),其中白果內(nèi)酯(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號(hào)110865-201507;銀杏內(nèi)酯A(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號(hào)為110862-201511;銀杏內(nèi)酯B(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號(hào)110863-201507;銀杏內(nèi)酯C(純度≥ 98%)生產(chǎn)批號(hào)110864-201507。95%乙醇、石油醚和酸性氧化鋁為分析純,甲醇、異丙醇為色譜純。

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 銀杏內(nèi)酯的分析方法

    所有的樣品都用Agilent 1260串聯(lián)385-ELSD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),使用YMC-Pack ODS-A( 4.6 mm×250 mm,5 μm) 的色譜柱進(jìn)行分析,根據(jù)分離度最大(實(shí)際測(cè)得分離度R>7.2)、檢測(cè)時(shí)間適宜的要求選用流動(dòng)相為異丙醇:水(10:90,V/V),流速為1 mL/min,氣體流速為1.60 L/min (氮?dú)?,漂移管穩(wěn)定溫度為 90 °C。

    2.2 銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定

    稱取銀杏葉樣品量20.0 g,加熱回流,冷卻到室溫用定性濾紙(型號(hào)為102)進(jìn)行過濾,分別回收不同試驗(yàn)條件下的銀杏內(nèi)酯提取液,濃縮提取液,用甲醇定容到500 mL容量瓶中,室溫超聲30 min,混勻,靜置,取適量樣品用針頭式微孔過濾器濾過0.22 mm有機(jī)濾膜后進(jìn)行高效液相色譜(HPLC-ELSD)檢測(cè),以10%異丙醇為流動(dòng)相檢測(cè)樣品含量(液相色譜圖見圖2),為確保此方法的準(zhǔn)確性,進(jìn)行精密度試驗(yàn)以及線性關(guān)系考察。

    BB為白果內(nèi)酯;A為銀杏內(nèi)酯A; B為銀杏內(nèi)酯B; C為銀杏內(nèi)酯C a 標(biāo)準(zhǔn)樣品 b 提取樣品圖2 銀杏內(nèi)酯高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of ginkgolides

    2.3 分析方法的驗(yàn)證

    2.3.1 線性相關(guān)性

    分別精密稱取銀杏內(nèi)酯BB、C、A、B標(biāo)準(zhǔn)樣品17.2、9.3、10.3、8.7 mg,用甲醇分別定容到50 mL,根據(jù)精密稱定樣品的量得到標(biāo)準(zhǔn)品BB、C、A、B溶液濃度分別為0.344 0、0.186 0、0.206 0、0.174 0 mg/mL,通過自動(dòng)進(jìn)樣器控制進(jìn)樣體積得到BB進(jìn)樣量為0.002 0、0.004 0、0.006 0、0.008 0、0.010 0 mg;C、A、B進(jìn)樣量為0.001 0、0.002 0、0.003 0、0.004 0、0.005 0 mg;得到樣品進(jìn)樣量與響應(yīng)值峰面積的對(duì)數(shù)的線性相關(guān)性。其相關(guān)性方程及R2見表1。

    表1 4種銀杏內(nèi)酯線性方程及R2Table 1 Linear equation of the four ginkgolides and R2

    2.3.2 精密度試驗(yàn)

    日間精密度試驗(yàn):取上述配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,連續(xù)6 d每天同一時(shí)間分別取樣測(cè)定4種銀杏內(nèi)酯,得到高效液相色譜響應(yīng)值峰面積,分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

    日內(nèi)精密度試驗(yàn):取上述配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,在1 d內(nèi)每隔2 h取一次樣,取6次分別測(cè)定樣品,得到高效液相色譜響應(yīng)值峰面積,分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表2。

    表2 精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Accuracy experiment RSD

    2.3.3 樣品加樣回收率的測(cè)定

    精密稱定銀杏內(nèi)酯BB、C、A、B標(biāo)準(zhǔn)樣品5.8、2.6、3.0、4.5 mg,加到上述標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中定容到50 mL容量瓶中,得到0.460 0、0.238 0、0.266 0、0.264 0 mg/mL的溶液,分別取適量樣品進(jìn)高相液相色譜檢測(cè)并重復(fù)3次,得到的回收率平均值為99.2%、98.8%、99.7%、99.6%。以上試驗(yàn)證明,方法是可靠、準(zhǔn)確的。

    2.4 銀杏內(nèi)酯的提取率

    本試驗(yàn)以銀杏內(nèi)酯提取率作為指標(biāo),選取最佳銀杏葉提取工藝。準(zhǔn)確稱取樣品20.0 g,經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)處理樣品,過濾殘?jiān)?,濃縮提取液,用甲醇定容到500 mL,進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),通過2.2中的方法計(jì)算銀杏內(nèi)酯含量,計(jì)算提取率。銀杏內(nèi)酯包括白果內(nèi)酯(BB)、銀杏內(nèi)酯A(A)、銀杏內(nèi)酯B(B)和銀杏內(nèi)酯C(C)的總和。具體的計(jì)算見公式(1):

    (1)

    2.5 單因素試驗(yàn)

    主要考察提取次數(shù)、提取時(shí)間(h)、乙醇的體積分?jǐn)?shù)和料液比(g / mL)對(duì)銀杏內(nèi)酯提取率的影響,按照2.2方法測(cè)定銀杏內(nèi)酯,并計(jì)算提取率。

    2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    本研究以銀杏內(nèi)酯提取率為指標(biāo),通過加熱回流的方式考察影響含量的主要因素及最佳提取條件,即提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù),選取如下水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)的因素水平見表3。

    表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factor level table of orthogonal experiment design

    3 結(jié)果與分析

    3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

    3.1.1 不同提取次數(shù)對(duì)銀杏內(nèi)酯提取率的影響

    當(dāng)選擇提取條件為料液比1:5,提取2 h,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí),選取提取次數(shù)分別為 1~7 次,由圖3a可知增加提取次數(shù)有利于提取率的提高,當(dāng)提取次數(shù)小于3次時(shí)提取率隨提取次數(shù)增加而增加,銀杏內(nèi)酯提取量增加;大于3 時(shí),銀杏內(nèi)酯提取率趨于平穩(wěn),表明銀杏葉中的內(nèi)酯接近提取完全,提取次數(shù)再多提取成本變大。

    圖3 單因素試驗(yàn)中不同條件對(duì)銀杏內(nèi)酯提取率的影響Fig.3 Impact of different conditions in single-factor experiment on extraction rate of ginkgolide

    3.1.2 不同提取時(shí)間對(duì)銀杏內(nèi)酯提取率的影響

    當(dāng)選擇提取條件為料液比 1:5,提取 3 次,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí),分別選擇提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h,由圖3b可知隨著提取時(shí)間的增加,提取愈發(fā)完全,溶液中銀杏內(nèi)酯含量增加,所以提取率增大。但在 2 h 之后,增加提取時(shí)間,提取率基本穩(wěn)定,為節(jié)約資源和時(shí)間,2 h最佳。

    3.1.3 不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)銀杏內(nèi)酯提取率的影響

    當(dāng)選擇提取條件為料液比 1:5,提取時(shí)間2 h,提取次數(shù)為 3 次,乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇0,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%時(shí),由圖3c可知乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí),銀杏內(nèi)酯的提取率最高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于40%時(shí)銀杏內(nèi)酯的提取率下降,這可能是由于提取溶液極性變化有關(guān)。

    3.1.4 不同料液比對(duì)銀杏內(nèi)酯提取效果的影響

    當(dāng)選擇提取條件為提取 3 次,提取時(shí)間2 h時(shí),在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%的條件下,選取料液比為 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25,由圖3d可知料液比(g/mL)大于 1:15時(shí),乙醇溶液對(duì)銀杏內(nèi)酯提取效果不好,提取率較低。隨著料液比的減小,即溶劑量的增加,有利于銀杏內(nèi)酯的充分溶解,所以提取率增加。在料液比小于 1:15時(shí),提取率趨于穩(wěn)定。

    3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    按L9(34)正交設(shè)計(jì)研究乙醇溶液加熱回流提取銀杏內(nèi)酯,以4種銀杏內(nèi)酯總量為指標(biāo),正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

    表4 銀杏內(nèi)酯提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results of extraction technology of ginkgolides

    通過表5方差分析可知,乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)銀杏內(nèi)酯含量有顯著影響,且影響程度乙醇體積分?jǐn)?shù)大于提取次數(shù),其影響順序?yàn)镃>D>A>B,得出最佳提取工藝為A1B2C3D3,即提取時(shí)間1.5 h,料液比1:20,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,提取次數(shù)3次時(shí),銀杏內(nèi)酯提取率最高。

    表5 銀杏內(nèi)酯正交提取試驗(yàn)方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal extraction experiment of ginkgolides

    3.3 驗(yàn)證結(jié)果

    為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化工藝的可靠性及穩(wěn)定性,取3份藥材各20 g,按上述最佳提取工藝即提取時(shí)間1.5 h,料液比1:20,乙醇濃度50%,提取次數(shù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),操作方法同前。結(jié)果表明,銀杏內(nèi)酯平均提取率為0.6786%,RSD為0.83%,表明此工藝穩(wěn)定可行。

    4 結(jié)論

    本試驗(yàn)以銀杏葉為原料,通過正交試驗(yàn)的方法確定最佳的提取工藝為提取時(shí)間1.5 h、料液比1:20、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取次數(shù)3次。此方法可以用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn),提高銀杏內(nèi)酯的提取率,減少生產(chǎn)成本。通過優(yōu)化銀杏內(nèi)酯的檢測(cè)方法,用異丙醇做流動(dòng)相,可以減少雜質(zhì)對(duì)被測(cè)物質(zhì)的干擾,并提高被測(cè)物質(zhì)的分離度(R>7.2),改善峰形,更加快速高效地測(cè)定提取物中銀杏內(nèi)酯的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明,本方法準(zhǔn)確、可靠。

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    Extraction technology of ginkgolides fromGinkgobilobaleaves

    LI Wen-dong1,2, GAO Qian-shan2,YANG Peng3, YANG Bing-tian3,WANG Xiao2*

    (1.School of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 3. Jinan Senkang Sanfeng Biological Engineering Co. LTD, Jinan 250014, China)

    ∶We determined optimum extraction condition ofGinkgobilobaleaves with the extraction rate of ginkgolides (ginkgo lactone, ginkgolides A, ginkgolide B and ginkgolide C) as an index. We employed orthogonal experiment to systematically investigate the impact of extraction time, solid-liquid ratio, ethanol concentration, and extraction time on extraction technology ofGinkgobilobaleaves. Ginkgolides content was determined through optimization of high performance liquid chromatography (HPLC-ELSD) and isopropanol of mobile phase. We also calculated extraction rate. Optimum extraction conditions are extraction time of 1.5 h, solid-liquid ratio of 1:20, ethanol concentration of 50% and extraction times of 3. This technology can improve extraction rate of ginkgolides, save testing cost, and is applicable to industrial production.

    ∶Ginkgobilobaleaves; ginkgolides; orthogonal experiment; extraction rate; isopropyl alcohol

    10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.005

    2016-02-22

    山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GZX219003)

    李文東(1990—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

    *通信作者,王曉,男,研究員,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。Email:wangx@sdas.org

    R284.2; O656.3

    A

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