豬流行性腹瀉病毒疫苗株在Vero細胞中繁殖條件的優(yōu)化

王 琳 邢育鋼 李繼昌 東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 150030

本實驗對豬流行性腹瀉病毒疫苗株在Vero 細胞中的增殖規(guī)律進行了進一步探索，以獲得該疫苗株增殖的最佳條件，從而為豬流行性腹瀉病毒細胞疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

（1）毒株。豬流行性腹瀉病毒疫苗株（CV777）由本單位提供。病毒粒子濃度為5×108PFU/mL。

（2）主要試劑。DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司，進口胎牛血清購自Hyc1one，胰酶購自Washington公司。

（3）細胞及傳代培養(yǎng)。Vero 細胞來自哈爾濱獸醫(yī)研究所，在本實驗室已擴增凍存，目前在本實驗室傳至130 代，已經(jīng)適應在本實驗室的培養(yǎng)基中生長。滿瓶的Vero 細胞用0.25%胰酶-EDTA 消化脫壁后，用10%DMEM 培養(yǎng)基（含10%進口胎牛血清）終止消化并稀釋到2～3×105個/mL，在10L 轉(zhuǎn)瓶（內(nèi)壁表面積約為4000cm2)中加入培養(yǎng)基1000mL，細胞重新貼壁以后密度約為5～6×104個/cm2，在37℃恒溫中，轉(zhuǎn)瓶機釆用12 轉(zhuǎn)/h 培養(yǎng)72h，細胞長成單層以后密度約為4×105個/cm2，用于接毒或傳代。

（4）PEDV 在六孔板培養(yǎng)體系中的繁殖試驗。取長滿Vero 細胞的六孔板（每孔直徑為3.5cm，表面積為9.5cm2)兩塊（做兩組平行對照，分別標記為NC1 組、NC2 組），每孔細胞密度約為4×105個/cm2，棄去培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液洗滌三次，以去除殘留培養(yǎng)基。每孔加入200μL 病毒液，5%CO2培養(yǎng)箱中37°C 吸附1h，棄去病毒液，補加維持液（不含血清的DMEM 培養(yǎng)基）2mL，胰酶濃度為5μg/mL，每板留一孔不接毒只更換維持液作為空白對照，接毒后置于5%CO2培養(yǎng)箱中37°C 進行培養(yǎng)，每隔12h 觀察細胞病變情況，同時收取每孔的細胞培養(yǎng)上清，3000 rpm 離心5min 后放入-20°C 保存，至接毒后72h。最后收取空白對照孔細胞培養(yǎng)上清，上清樣凍融后，按照Reed-Muench 法計算TCID／0.1mL。

TPCK 胰酶濃度對病毒在Vero 細胞中增殖的影響。按照1.4 步驟中摸索的初步條件，分別在接毒后加入TPCK-胰酶終濃度為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、7.5μg /mL、10μg /mL 和不加胰酶6 組接毒試驗，每組做2 組平行。比較各組結(jié)果，以確定TPCK-胰酶對病毒在Vero 細胞中增殖的最佳濃度。

接毒量對病毒在Vero 細胞中增殖的影響。在最佳TPCK 胰酶濃度條件下，分為4 個不同接毒劑量組，分別病毒粒子濃度為5×108PFU/mL 的病毒，MOI 分別為1、0.1、0.01、0.001 每個接毒劑量設(shè)置2個平行對照組，設(shè)1 組只更換維持液無病毒的空白對照，比較各組結(jié)果，以確定最佳接毒劑量。

（5）PEDV 在10L 轉(zhuǎn)瓶中增殖試驗。根據(jù)在6孔板中探索的最優(yōu)條件，接毒后10L 轉(zhuǎn)瓶的維持液體積為1000mL。共接毒3 個10L 轉(zhuǎn)瓶，接毒后每隔12h 收取細胞培養(yǎng)上清，3000rpm 離心5min 后放入-25℃保存，直至接毒后72h，上清樣品凍融后，按照按Reed-Muench 法計算TCID／0.1mL。

2 結(jié)果

2.1 六孔板病毒增殖試驗結(jié)果

（1）細胞病變情況。接毒后每隔12h 觀察細胞病變，發(fā)現(xiàn)接毒后18h 少數(shù)細胞病變，24h 后細胞出現(xiàn)明顯病變，細胞腫脹變圓，折光性增加，顆粒物質(zhì)增多，培養(yǎng)后期出現(xiàn)細胞脫落。

圖1 接毒前后Vero 細胞的形態(tài)觀察

（2）六孔板中病毒增殖試驗結(jié)果。接毒后采取的細胞培養(yǎng)上清進行毒價檢測，結(jié)果見表1。在接毒后60h 病毒增殖滴度達到峰值1×106.3TCID50/0.1mL，空白對照無病變。峰值可維持12h、72h 以后病毒效價略有下降。

表1 六孔板屮接毒Vero 細胞后不同時間點病毒滴度（TCID50/ 0.1mL)

（3）接毒量對病毒在Vero 細胞中增殖的影響結(jié)果。對保存的10L 轉(zhuǎn)瓶中Vero 細胞接毒樣品進行TCID50 檢測，空白對照組無病變，其余各組檢測結(jié)果見圖2。接毒量MOI 為0.1、1 時病毒均能獲得較好的增殖，病毒效價峰值均可以達到1×106.5TCID50/0.1mL，而當接毒量小于0.1 時，病毒的感染量較低，效價上升速度慢，最終未能達到峰值。

圖2 不同接毒量對病毒在Vero 細胞中增殖結(jié)果

（4）胰酶濃度對病毒在Vero 細胞中増殖影響的結(jié)果。對加入不同濃度胰酶條件下病毒增殖檢測結(jié)果見圖3。當胰酶濃度低于5μg/mL，病毒增殖速度明顯減慢，毒價未能達到峰值，當胰酶濃度為7.5μg/mL 時，病毒增殖較穩(wěn)定，毒價能達到峰值。當胰酶濃度達到10μg/mL 時，細胞很快在3～4h 內(nèi)被胰酶消化脫落，因此病毒無法增殖，表明該疫苗株在Vero 細胞中增值的最佳胰酶濃度為7.5μg/mL。

圖3 不同濃度胰酶條件下病毒增殖的TCID50 檢測結(jié)果

2.2 PEDV 在10L 轉(zhuǎn)瓶中增殖試驗結(jié)果

對3 個10L 轉(zhuǎn)瓶中Vero 細胞的接毒試驗樣品進行病毒效價檢測，結(jié)果見圖4。接毒后12h 即可檢測到病毒效價，隨時間延長逐漸上升，在60h 能達到最高，且峰值可以維持到72h,之后開始下降。

圖4 PEDV 在10L 轉(zhuǎn)瓶中增殖試驗結(jié)果

3 討論

本試驗對PEDV 疫苗株在6 孔板和10 L 轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模增殖的條件進行了研究，在比較試驗結(jié)果后確定胰酶終濃度為7.5μg／mL 作為該疫苗株大規(guī)模增殖的最佳濃度；最佳接毒劑量選擇MOI=1，在此條件下病毒增殖最高毒價均可以達到106.0/0.1mL 以上，充分說明該疫苗株具有高度適應在Vero 細胞大規(guī)模增殖的特性，為該疫苗株應用于大規(guī)模生產(chǎn)提供了依據(jù)。

本試驗在確定最佳胰酶終濃度時發(fā)現(xiàn)，該疫苗株在Vero 細胞大規(guī)模增殖過程中，胰酶的加入是必不可少的。同時在對加入不同胰酶濃度進行比較中發(fā)現(xiàn)，在濃度為5～7.5μg／mL 范圍內(nèi)病毒增殖速度隨胰酶濃度的增加上升。這是因為PEDV毒株不同而引起對胰酶的敏感性有所差異。另外不同代次Vero 細胞對病毒增殖的敏感性不同也是引起病毒增殖對胰酶依賴性不同的重要因素。

[1]徐國棟,李 峰,張廣峰.國內(nèi)豬流行性腹瀉防治概況.畜牧與獸醫(yī)，2011，43:88-93.

[2]張世忠,江 斌.2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點及其防治措施.福建畜牧獸醫(yī)，2012，34:23-25.

[3]李 龍.仔豬流行性腹瀉的最新流行情況.養(yǎng)豬，2011，（5）:87-88.