天麻提取物對灰樹花深層發(fā)酵胞外蛋白合成的影響

黃 忠

吳天祥

楊祖滔

朱思潔

(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

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天麻提取物對灰樹花深層發(fā)酵胞外蛋白合成的影響

黃 忠

吳天祥

楊祖滔

朱思潔

(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

在灰樹花深層發(fā)酵系統(tǒng)中加入天麻提取物，以灰樹花生物量和胞外蛋白合成量為指標(biāo)，對天麻提取物添加量進(jìn)行優(yōu)選；利用HPLC對天麻提取物成分進(jìn)行分析，研究天麻提取物滅菌前后主要成分(天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛及巴利森甙)含量的變化，并研究其促進(jìn)灰樹花生物量和胞外蛋白合成的關(guān)鍵成分在灰樹花發(fā)酵體系中的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7%(體積分?jǐn)?shù))天麻提取物可以促進(jìn)灰樹花菌絲體生長和胞外蛋白的合成，生物量和胞外蛋白合成量在發(fā)酵第11天時達(dá)到最大值；在天麻提取物滅菌后，巴利森甙含量明顯減少，天麻素含量明顯增加；天麻提取物加入灰樹花發(fā)酵體系14 d后，天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛含量均降低，但巴利森甙含量增加了161.11%。

天麻；提取物；灰樹花；深層發(fā)酵；胞外蛋白；生物量

天麻(GastrodiaelataBl.) 為蘭科多年生寄生菌植物，是一種名貴的中藥材，主要產(chǎn)于貴州、云南及四川等地，其主要成分包括天麻素(gastrodin)、對羥基苯甲醛(p-hydroxylbenzaldehyde)、對羥基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol)等[1-2]。

灰樹花(Grifolafrondosa)又名栗子蘑、貝葉多孔菌等，是一種高檔的珍稀食用菌，同時灰樹花還是珍貴的藥用真菌，具有極高的營養(yǎng)和保健價值[3-4]。灰樹花的化學(xué)成分主要有多糖、蛋白質(zhì)、多酚、核酸、微量元素等，其中灰樹花蛋白質(zhì)中含有多種氨基酸，特別是色氨酸的含量較高，因此當(dāng)灰樹花和其他食物一起食用時，能夠起到氨基酸的互補(bǔ)作用；還含有較高的天冬氨酸和谷氨酸，具有抗疲勞和保護(hù)人腦神經(jīng)的作用[5-6]。

近些年國內(nèi)外的科研文章表明，真菌蛋白已表現(xiàn)出顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗腫瘤作用[7-8]；灰樹花中提取的小分子蛋白具有抗HSV-1的作用[9]，刺激小鼠自然殺傷樹突狀細(xì)胞和增強(qiáng)小鼠抗腫瘤免疫[10]，分離得到的熱穩(wěn)定蛋白具有抑制煙草花葉病毒(TMV)侵染活性[11]，而且灰樹花抗腫瘤多糖組分中含有的1%～20%的蛋白可能具有獨特作用[12]。

本課題組[13-18]之前的研究表明，中藥尤其是天麻提取物能夠有效促進(jìn)灰樹花菌絲體生長和胞外多糖合成，而天麻提取物對灰樹花的另一重要活性物質(zhì)灰樹花蛋白的影響未進(jìn)行研究，本試驗通過研究天麻醇提物對灰樹花胞外蛋白合成的影響以及對灰樹花胞外蛋白合成起關(guān)鍵作用的物質(zhì)，以期為后期相關(guān)代謝組學(xué)和基因組學(xué)的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

天麻：貴州省德江縣的天麻種植基地；

灰樹花菌株(ACCC51616)：中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

KH2PO4：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

蛋白胨：分析純，上海盛思生化科技有限公司；

MgSO4·7H2O：分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；

無水乙醇：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；

天麻素標(biāo)品：化學(xué)純，成都曼思特生物科技有限公司；

對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森甙：化學(xué)純，美國Sigma公司；

磷酸：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

其余試劑均為市售分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

立式滅菌鍋：BXM-30R型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

紫外可見分光光度計：UV-7502PC 型，上海欣茂儀器有限公司；

低速離心機(jī)：TG2-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

凈化工作臺：SW-CJ-1D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9070 MBE型，上海博迅實業(yè)有限公司；

電子天平：CP114型，上海奧豪斯儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水真空泵：SHZ-III型，上海亞榮生化儀器廠；

高效液相色譜儀及檢測器：Agilent 1100型，安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 天麻預(yù)處理及制備天麻提取物流程 將天麻用清水洗凈，在55 ℃條件下烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過80目篩后得到天麻粉末備用。精確稱取天麻粉末10 g，加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液100 mL，常溫(25 ℃左右)浸泡48 h后過濾得濾液，然后將濾液60 ℃減壓蒸餾除去乙醇至浸膏狀，將濃縮物重溶于蒸餾水中，定容到100 mL，即得天麻提取液。

1.2.2 培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)方法

(1) 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯(去表皮)200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO42 g/L，pH 值自然。

(2) 種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母膏6 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH值自然。

(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO42 g/L，蛋白胨5 g/L，pH值自然。

(4) 斜面種子培養(yǎng)方法：在母種管中用接種鏟取黃豆粒大小的菌絲塊到斜面培養(yǎng)基的中部，接種完成后置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲布滿斜面。

(5) 種子液培養(yǎng)方法：用接種扒在培養(yǎng)好的菌種斜面上盡可能多地刮取綠豆大小顆粒，接種于滅菌后的液體種子培養(yǎng)基中，每支種子管接種1瓶種子液。三角錐形瓶(250 mL)裝液量為100 mL并放置一個轉(zhuǎn)子，150 r/min、25 ℃、搖床培養(yǎng)7 d，每天將種子液置于旋轉(zhuǎn)儀上均勻3～5 min，待三角錐形瓶中長出大量均勻細(xì)小的菌絲球且培養(yǎng)液清亮即可。

(6) 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)方法：每瓶發(fā)酵液按照每100 mL發(fā)酵液接種10 mL種子液的接種量接種。用移液槍吸取種子液10 mL，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。250 mL三角錐形瓶裝液量為100 mL，并置于150 r/min、25 ℃的恒溫?fù)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間按試驗設(shè)計設(shè)定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用考馬斯亮藍(lán)法[19]。精確稱取10 mg牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入到100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容后搖勻，即得0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，分別取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，再分別向具塞試管中加入配制好的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL，搖勻后，避光反應(yīng)5～10 min后，在最大吸收波長595 nm處測定其吸光度值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 胞外蛋白的測定及計算方法 將待測發(fā)酵液用移液管移入離心管中，置于離心機(jī)中在4 000 r/min離心10 min，待結(jié)束后，取一定量上清液并加蒸餾水至1 mL，加入配制好的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL，搖勻，避光反應(yīng)5～10 min后，在595 nm處測定其吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出所取上清液中所含胞外蛋白質(zhì)量。胞外蛋白計算公式：

(1)

式中：

M——胞外蛋白總量，mg；

m1——所取上清液中蛋白質(zhì)量，mg；

n——所取上清液占發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5 生物量測定 灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)(溫度25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min)一定時間以后，將灰樹花發(fā)酵液用紗布過濾后，用蒸餾水反復(fù)清洗并盡量擠干菌絲體，得到的濕菌絲體置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重后稱量。

1.2.6 HPLC檢測條件 色譜柱: Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.1%磷酸水(A)和乙腈(C)，以梯度洗脫：0～35 min，C 3%～30%(體積分?jǐn)?shù))；35～40 min，C 30%～100%(體積分?jǐn)?shù))；40～45 min，C 100%～3%(體積分?jǐn)?shù))。柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長221 nm。

1.2.7 試驗數(shù)據(jù)處理及繪圖 試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，并采用Origin 9.0和Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在波長為595 nm處測量牛血清蛋白標(biāo)品不同濃度的吸光度，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)， 吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y= 8.740 5x+ 0.009 3，R2= 0.999 2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve

2.2 天麻提取物濃度對灰樹花生物量和胞外蛋白的影響

在灰樹花深層發(fā)酵體系中添加不同濃度的天麻提取物，發(fā)酵12 d后生物量和胞外蛋白見圖2。由圖2可知，隨著天麻提取物體積分?jǐn)?shù)的增加，灰樹花菌絲體和胞外蛋白的產(chǎn)量也逐漸增高，在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到7%時，灰樹花菌絲體和胞外蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最大，與對照組(不添加天麻提取物)相比，分別增加了50.65%和13.21%。真核生物細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重要的功能是促進(jìn)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的折疊和修飾，此過程需要分子伴侶以及折疊酶的協(xié)助，包括：鈣連蛋白與鈣網(wǎng)蛋白、重鏈結(jié)合蛋白(binding protein，BiP)和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)等，這可能是天麻提取物能促進(jìn)或增強(qiáng)這些蛋白和酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的功能[20-22]；也可能是天麻提取物在增加基因拷貝數(shù)、降低蛋白水解活力及與內(nèi)源基因融合等促進(jìn)胞外蛋白分泌的方式中發(fā)揮著重要作用[23]。而天麻提取物的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步提高時，灰樹花菌絲體和胞外蛋白的產(chǎn)量開始下降。因此，初步研究表明，天麻提取液的體積分?jǐn)?shù)為7%(相當(dāng)于天麻量約為7 g/L)時能夠最大程度地促進(jìn)灰樹花菌絲體的生長和胞外蛋白的合成。

2.3 灰樹花深層發(fā)酵過程中生物量和胞外蛋白的動態(tài)變化

圖3和圖4為對照(不添加天麻提取物)和體積分?jǐn)?shù)7%天麻提取物兩個試驗組在灰樹花深層發(fā)酵(13 d)期間生物量和胞外蛋白隨發(fā)酵天數(shù)的動態(tài)變化曲線。在此發(fā)酵過程中，兩組的生物量逐漸增加到最大值后趨于平衡，胞外蛋白量先減少后增加至最大值后趨于平衡。在發(fā)酵0～5 d時，兩組的生物量較低且相差不大；5～11 d時，生物量開始快速增加；11 d后趨于穩(wěn)定。這表明從發(fā)酵的第5天開始，菌絲體開始大量利用發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)來促進(jìn)菌絲體的生長；而且，在深層發(fā)酵7 d后，天麻提取物組的生物量顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 天麻提取物濃度對灰樹花生物量和胞外蛋白的影響Figure 2 Effect of the concentrations of Gastrodia elata Bl. extracts on biomass and exocellular protein productions by submerged culture of Grifola frondose

圖3 動態(tài)分析發(fā)酵時間對灰樹花生物量的影響Figure 3 Kinetic analysis of the effect of Culture time on biomass of Grifola frondosa

圖4 動態(tài)分析發(fā)酵時間對灰樹花胞外蛋白的影響Figure 4 Kinetic analysis of the effect of Culture time on extracellular protein of Grifola frondosa

在發(fā)酵0～3 d時，兩組的胞外蛋白逐漸降低，表明菌絲體在吸收利用胞外蛋白，而且試驗組的吸收速率大于對照組；3～11 d時，胞外蛋白開始快速增加；11 d后趨于穩(wěn)定。這表明從發(fā)酵的第3天開始，菌絲體開始大量分泌胞外蛋白，在深層發(fā)酵9 d后，天麻提取物組的胞外蛋白量顯著高于對照組(P<0.05)。試驗結(jié)果表明，灰樹花在深層發(fā)酵11 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，此時灰樹花生物量及胞外蛋白含量最高。

2.4 天麻提取物主要成分分析

由表1可知，天麻醇提物成分的含量滅菌前后發(fā)生了很大的變化。對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛的含量分別增加47.09%和24.69%。天麻素的含量明顯增加，而巴利森甙的含量明顯降低，可能是巴利森甙在高溫高壓的條件下分解產(chǎn)生了天麻素[24]64-67。

2.5 天麻醇提物各成分在灰樹花發(fā)酵前后含量的變化

在探究天麻醇提物對灰樹花菌絲體生長和產(chǎn)胞外蛋白的影響的同時，跟蹤和檢測天麻醇提物各成分在灰樹花發(fā)酵期間的變化。發(fā)酵第0天、第14天及空白組的色譜圖見圖5。

表1 天麻提取物滅菌前后成分含量的變化

Table 1 Change components content forGastrodiaelataBl. extracts before and after sterilization

mg/g

GA. 天麻素 HA. 對羥基苯甲醇 HBA. 對羥基苯甲醛

parishin. 巴利森甙

圖5 發(fā)酵第0天、第14天及空白組的色譜圖

Figure 5 HPLC chromatogram of the experimental group of 0 d, 14 d and the control group

通過峰面積的比對計算，得到相應(yīng)成分的含量值，見表2。由表2可知，空白組(未添加天麻成分)沒有檢測到天麻的任何成分，而試驗組在發(fā)酵第14天與第0天相比，天麻素含量降低了47.86%；對羥基苯甲醇含量下降了11.84%；對羥基苯甲醛含量下降了74.64%；而巴利森甙含量提高了161.11%。綜合4種主要成分的變化情況可以發(fā)現(xiàn)，天麻素可能在灰樹花生長過程中重新合成了巴利森甙，因為巴利森甙化學(xué)結(jié)構(gòu)是由3個天麻素分子和1個檸檬酸分子連接而成[24]64-67；對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛等物質(zhì)可能作為含碳有機(jī)物被灰樹花吸收利用，因為微生物生長需要的碳源大多來自含碳有機(jī)物，也可能被灰樹花自身酶系轉(zhuǎn)化合成為一種新物質(zhì)。

表2 天麻提取物在灰樹花發(fā)酵過程中的變化?

Table 2 The changes ofGastrodiaelataBl. extracts inGrifolafrondosafermentation mg/100 mL

? —表示未檢出。

3 結(jié)論

通過添加適宜體積分?jǐn)?shù)的天麻提取物到灰樹花發(fā)酵體系中可以顯著促進(jìn)灰樹花菌絲體的生長及胞外蛋白的生物合成，確定了天麻提取物濃度為7%(體積分?jǐn)?shù))；動態(tài)分析了7%(體積分?jǐn)?shù))天麻提取物對灰樹花生物量和胞外蛋白合成量的影響，灰樹花在深層發(fā)酵11 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，此時灰樹花生物量及胞外蛋白含量最高，分別達(dá)到2.898 g/L和87.152 mg/L；目前，可以從真菌蛋白表達(dá)和分泌相關(guān)的基因組學(xué)及功能基因組學(xué)上進(jìn)行研究，以闡明與蛋白產(chǎn)量相關(guān)的分泌和翻譯后修飾等機(jī)制[25]。利用HPLC對天麻提取物成分進(jìn)行分析，研究了天麻提取物滅菌前后主要成分(天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛及巴利森甙)含量的變化，對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛的含量增加量較低，巴利森甙含量明顯減少，天麻素含量明顯增加；并研究其促進(jìn)灰樹花生物量和胞外蛋白合成的關(guān)鍵成分在灰樹花發(fā)酵體系中的含量變化，天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛含量均降低，但巴利森甙含量增加了161.11%；可能是這些關(guān)鍵成分作為含碳有機(jī)物被灰樹花吸收利用了，或者是在灰樹花菌體中進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，微生物體內(nèi)往往含有大量的酶類能夠?qū)⒁恍┑孜镛D(zhuǎn)化合成為另一種新物質(zhì)，接下來仍需要對灰樹花生物轉(zhuǎn)化天麻成分進(jìn)行研究，而且中藥的轉(zhuǎn)化也是近來研究比較多的一個領(lǐng)域。

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Effect of Gastrodia elata Bl. extracts on the biosynthesis of extracellular proteins in the Grifola frondosa under submerged fermentation

HUANG Zhong

WUTian-xiang

YANGZu-tao

ZHUSi-jie

(SchoolofLiquor&FoodEngineering,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

GastrodiaelataBl. extracts was added into the system ofGrifolafrondosasubmerged fermentation, and then supplement-ation ofGastrodiaelataBl. extracts were optimized according to the biomass and the synthetic quality of extracellular proteins inG.frondosa. The changes of components inG.elataBl. extracts before and after the sterilization, including gastrodin, p-hydroxybenzyl alcohol, p-hydroxybenzaldehyde, and parishin, were analyzed using HPLC. Moreover, the relationship of this changes betweenG.elataBl. extracts and the inG.frondosafermentation system were also investigated. The results revealed that 7% (v/v)G.elataBl. extracts could facilitateG.frondosato grow and produce extracellular proteins, and the content of two experimental indexes reached the maximum 11 days after the submerged fermentation ofG.frondosa. It was found that the content of parishin in the extracts fromG.elataBl. decreased after sterilization, while the content of gastrodin increased obviously. Furthermore, the extracts fromG.elataBl. were added into the system ofG.frondosasubmerged fermentation and then they were incubated for 14 days. Finally, the contents of p-hydroxybenzyl alcohol and p-hydroxybenzaldehyde decreased, nevertheless parishin increased by 161.11%.

GastrodiaelataBl. extracts;Grifolafrondosa; submerged fermentation; extracellular protein; biomass

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：[2014]31460537)

黃忠，男，貴州大學(xué)在讀碩士研究生。

吳天祥(1965—)，男，貴州大學(xué)教授，博士。 E-mail:txwu@gzu.edu.cn

2016—08—12

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.006