R.B1L型及 R.CL型糖苷酶對豆?jié){異黃酮構(gòu)型的影響及風味的改善

周煒杰

夏 蓉3

朱崇陽1,2

裴 靜4

陶匯源3

程永強1,2

(1. 植物源功能食品北京市重點實驗室，北京 100083；2. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3. 鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；4. 英聯(lián)酶制劑貿(mào)易(上海)有限公司，上海 200050)

?

R.B1L型及 R.CL型糖苷酶對豆?jié){異黃酮構(gòu)型的影響及風味的改善

周煒杰1,2

夏 蓉3

朱崇陽1,2

裴 靜4

陶匯源3

程永強1,2

(1. 植物源功能食品北京市重點實驗室，北京 100083；2. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3. 鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；4. 英聯(lián)酶制劑貿(mào)易(上海)有限公司，上海 200050)

為獲得更高含量的大豆異黃酮苷元，同時改善豆?jié){的風味，采用糖苷酶(R.B1L型和R.CL型)對豆?jié){進行處理，而后通過高效液相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分別檢測大豆異黃酮和風味化合物。結(jié)果表明，豆?jié){中的大豆異黃酮苷元總量增加了7.289 μg/g，比對照組提高了35.7%；豆腥味化合物己醛和2-戊基呋喃減少了10.8%，香氣化合物正己醇和反-2-壬烯醛增加了10.88%。說明酶制劑為改善豆?jié){的品質(zhì)和風味提供了一種可行的方法。

豆?jié){；糖苷酶；大豆異黃酮；風味

豆?jié){是一種老少皆宜的飲品，其營養(yǎng)與保健價值均較高，不論在中國，還是在歐美都深受人們的喜愛[1]。作為一種植物蛋白飲料，豆?jié){的外觀與牛奶相似，且其營養(yǎng)不亞于牛奶。豆?jié){富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，且不含膽固醇[2]；其氨基酸配比與人體所需相近，易被人體吸收，生物價值較高[3]；豆?jié){富含具有保健功能的卵磷脂、異黃酮，有助于調(diào)節(jié)人體的生理功能。因此，在動物奶源供給不足的地區(qū)，豆?jié){可以代替牛奶，其廉價高營養(yǎng)的特性能夠滿足對蛋白質(zhì)需求量較大以及對牛奶過敏、患有乳糖不耐癥的人群[4]。

大豆異黃酮是大豆生長過程中形成的一種次級代謝產(chǎn)物，是大豆和豆?jié){中主要的生理活性成分[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可以預防甚至緩解多種慢性疾病，包括更年期綜合征、骨質(zhì)疏松等。目前發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮共有12種，主要有兩種存在形式：糖苷型和苷元型，其中豆?jié){中含量較高的有6種，分別為大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木苷元。大豆籽粒中異黃酮的比例約為：大豆苷30%～50%，染料木苷50%～60%。植物中的異黃酮大部分以β-葡萄糖苷的形式存在[7]，少量以游離形式存在。然而研究[8]表明，黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物利用率，可能是黃酮苷元比黃酮糖苷更容易被人和動物體吸收。高榮海等[8]試驗結(jié)果表明大豆異黃酮糖苷和苷元都能有效提高小鼠體液免疫功能，但是發(fā)現(xiàn)小鼠對大豆異黃酮苷元的吸收效果強于大豆糖苷，說明大豆異黃酮苷元的免疫功能優(yōu)于大豆異黃酮糖苷。

在西方國家，一直有研究致力于豆?jié){異味的消除。到目前為止，研究[9]表明豆?jié){一部分的異味是在加工過程中產(chǎn)生的。Kobayashi等[10]認為大豆豆腥味是由一類復雜化合物產(chǎn)生的，其中2-戊基呋喃呈現(xiàn)一種特殊的青草氣味和豆腥味，己醛具有草腥味，它們是造成豆?jié){異味的典型化合物，而正己醇和反-2-壬烯醛分別呈現(xiàn)水果香、黃瓜香，是豆?jié){中典型的香味化合物。也有研究[11]表明：皂苷、糖苷型異黃酮等酚類物質(zhì)具有苦味，被認為是造成豆?jié){異味的主要不揮發(fā)性化合物。因此，減少豆?jié){中的異味顯得十分重要。在此，本文僅對豆?jié){中己醛、2-戊基呋喃、正己醇和反-2壬烯醛這4種典型風味化合物的變化進行了研究。

ROHAMENT CL(R.CL)是一種β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶(Cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶，該酶可以水解β-1,4-糖苷鍵，能將大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為具有生物學活性的大豆異黃酮苷元。ROHAMENT B1L(R.B1L)是一種果膠纖維素復合酶，應用于豆?jié){生產(chǎn)工藝當中也可以起到水解β-1,4-糖苷鍵的作用。糖苷酶用于果汁等飲料中很常見，但加入到豆?jié){中還鮮有報道。與單一的糖苷酶比較，復合酶可以發(fā)揮協(xié)同作用，更加高效。因此，本試驗擬采用R.B1L和R.CL復合處理豆?jié){，目的是降低其豆腥味，提高其苷元型大豆異黃酮含量，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)豆?jié){。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大豆：大型超市；

糖苷酶R.B1L(9 600 PGU/mg)、糖苷酶R.CL(15 000 ECU/g)：最適反應溫度為55 ℃，建議添加量為0.01%～0.10%，英聯(lián)酶制劑貿(mào)易(上海)有限公司；

大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木苷元、乙腈、甲醇：色譜純，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：HPLC M20-A型，配備紫外檢測器，日本島津精密科學儀器公司；

色譜柱：CAPCELL PAK C18型，日本資生堂島津精密科學儀器有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：450-GC 220-MS型，美國Varian公司；

萃取頭：65 μm PDMS/DVB型，美國Sigma公司；

電子天平：YP80001型，上海越平科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆異黃酮含量的測定

(1) HPLC條件：色譜柱：CAPCELL PAK C185 μm，4.6 mm×250 mm；流動相：水相0.1 mL/100 mL冰醋酸，有機相乙腈/甲醇(體積比5∶2)；梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；二極管陣列檢測器(DAD)波長為254 nm[12]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

(2) 豆?jié){的制備：取100 g大豆，用800 g蒸餾水打漿；使用紗布將豆?jié){與豆渣分離，用5 min煮沸，然后冷卻到室溫。每次用于測試的豆?jié){樣品均制備3份。

(3) 酶解：向所得豆?jié){加入相當于豆?jié){體積0.01%(0.01 mL/100 mL)的糖苷酶(R.B1L和R.CL體積比1∶1)，于55 ℃恒溫水浴條件下水解30 min。

(4) 樣品前處理：基于殷麗君等[13]提取發(fā)酵豆制品中大豆異黃酮的方法，分別稱取原豆?jié){和水解后的豆?jié){1.0 g，加入80%甲醇2 mL，水浴震蕩提取4 h(80 ℃，160 r/min)，取上清液，過0.45 μm有機系濾膜，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，于4 ℃冰箱密封保存待用。

(5) 標準品的配制：分別取1.25 mg大豆苷，0.5 mg黃豆苷，1.25 mg染料木苷，0.8 mg大豆苷元，0.5 mg黃豆黃素和0.25 mg染料木苷元，置于25 mL容量瓶中，用色譜級甲醇配制成母液，超聲輔助(300 W，1 h)溶解并用色譜級甲醇定容至刻度，搖勻，再分別稀釋2，5，8，10，16倍，4 ℃避光保存，備用。

(6) 定性定量方法：將所測大豆異黃酮標準溶液在設定色譜條件下進樣，繪制標準曲線。以保留時間定性，峰面積定量，從而測得樣品中相應異黃酮的含量，結(jié)果以均值±標準差來表示。

1.2.2 風味物質(zhì)的檢測

(1) 萃取：準確量取8 mL豆?jié){于萃取瓶中，插入萃取頭，在55 ℃下萃取30 min。萃取完成后，拔出萃取頭，準備進樣。

(2) GC條件：色譜柱為JW DB-5MS石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持4 min，以6 ℃/min的速率升溫到230 ℃，保持5 min；不分流進樣；壓力33.4 kPa，載氣(He) 流速1.0 mL/min。

(3) MS條件：電離方式EI；電子能量70 eV；激活電壓350 V；進樣口溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z：40～400。

(4) 定性方法：使用保留指數(shù)(retention index，RI)輔助MS檢索進行定性。① MS鑒定：通過計算機譜庫對檢測到的揮發(fā)性化合物進行檢索，鑒定結(jié)果以匹配度大于80%的為準；② 保留指數(shù)鑒定：采用同樣的升溫程序，以C7～C23正構(gòu)烷烴為標準，通過保留時間計算樣品中各化合物的RI，并進行比較確認[14]。

(5) 定量分析：采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，采用OriginPro 8 SR3軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮的HPLC檢測結(jié)果

2.1.1 標準曲線的繪制 分別精確吸取1.2中各濃度的標準溶液，進樣量10 μL，按1.2中色譜條件進行HPLC檢測(圖1)，計算峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表2。

2.1.2 樣品異黃酮測定結(jié)果 采用表1的梯度洗脫程序，可在40 min內(nèi)實現(xiàn)6種大豆異黃酮的分離與鑒定，結(jié)果見圖2、3。

圖1 大豆異黃酮標樣色譜圖Figure 1 Chromatograms of soybean isoflavones standard sample表2 大豆異黃酮含量的線性關(guān)系Table 2 Linear relationship of soybean isoflavones content

成分回歸方程R2線性范圍/(μg·mL-1)大豆苷y=28924x+125650.99803～50黃豆苷y=26287x+3906.50.99811～20染料木苷y=37676x+5731.40.99803～50大豆苷元y=64532x+163740.99792～32黃豆黃素y=45736x+66440.99781～20染料木苷元y=268738x+3486.40.99810.6～10

圖2 對照組豆?jié){異黃酮色譜圖Figure 2 Chromatograms of soya-bean milk isoflavones from the control group

圖3 酶解組豆?jié){異黃酮色譜圖Figure 3 Chromatograms of soya-bean milk isoflavones from the enzymatic hydrolysis group

由表3可知，對照組與酶解組豆?jié){中各種大豆異黃酮的含量差異較明顯。經(jīng)過糖苷酶處理后，豆?jié){中的糖苷型大豆異黃酮：大豆苷和染料木苷的含量明顯減少；對應的苷元型異黃酮：大豆苷元和染料木苷元分別增加了4.95 μg/g和1.686 μg/g；由于豆?jié){中黃豆黃苷的含量非常低，所以它下降的幅度不是很明顯，但是黃豆黃素的含量仍然得到了提高。酶解組豆?jié){中的大豆異黃酮苷元總量增加了7.289 μg/g，比對照組提高了35.7%，此結(jié)果與文獻[15]基本一致，充分說明了酶處理可以增加苷元型大豆異黃酮的含量。

2.2 GC—MS檢測風味化合物的結(jié)果

由表4可知，以豆?jié){中2-戊基呋喃、己醛、正己醇和反-2-壬烯醛這4種典型風味化合物作為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過糖苷酶處理后的豆?jié){中豆腥味化合物己醛和2-戊基呋喃總共減少了10.8%，香氣化合物正己醇和反-2-壬烯醛總共增加了10.88%。這與發(fā)酵豆乳中微生物引起的風味變化機理相似，其實風味化合物主要是生化反應的副產(chǎn)物，豆乳發(fā)酵過程中的風味變化主要依賴于微生物分泌的酶[16]。由于酶的作用，促進了一些大分子化合物向小分子正常轉(zhuǎn)化，抑制了副產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，糖苷酶作用于豆?jié){，可能產(chǎn)生了新的風味物質(zhì)，同時破壞了發(fā)酵過程中異味物質(zhì)的生成。

表3 豆?jié){異黃酮含量?Table 3 Thecontent of soymilk isoflavones μg/g

? 同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表4 豆?jié){風味化合物含量?Table 4 The content of soymilk flavor compounds %

? 同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

本研究采用了兩種糖苷酶(R.B1L型和R.CL型)對豆?jié){進行處理，將糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型大豆異黃酮，從而增加了大豆異黃酮苷元的含量；此外，發(fā)現(xiàn)糖苷酶的加入改善了豆?jié){的風味與口感。

與前人的研究[10]相比，本試驗的獨特之處在于豆?jié){中糖苷酶的加入，并取得了理想的效果：降低了豆腥味化合物己醛和2-戊基呋喃的含量，提高了豆香味化合物正己醇和反-2-壬烯醛的含量，同時獲得了高含量的苷元型大豆異黃酮，說明本試驗采用的R.B1L型和R.CL型糖苷酶確實發(fā)揮了一定的功效，有利于豆?jié){行業(yè)擴大市場效益。但糖苷酶改善豆?jié){風味的作用機理還有待進一步的深入探究。

[1] POLISELI-SCOPEL F H, HEM(A)NDEZ-HERRERO M, GUAMIS B, et al. Characteristics of soymilk pasteurized by ultra high pressure homogenization (UHPH)[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2013, 20(10): 73-80.

[2] CHOU Cheng-chun, HOU Jen-wan. Growth of bifidobacteria in soymilk and their survival in the fermented soymilk drink during storage[J]. International Journal of Food Microbiology, 2000, 56(2): 113-121.

[3] 石彥國, 任莉. 大豆制品工藝學[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1993: 70.

[4] 呂玉翠. 豆?jié){和大豆?jié)饪s蛋白乳的熱處理對其品質(zhì)的影響[D]. 無錫: 江南大學, 2013: 34-36.

[5] 范紅艷, 顧饒勝, 王艷春, 等. 大豆異黃酮抗衰老作用研究[J]. 中草藥, 2010, 41(9): 2 054-2 057.

[6] 崔洪斌. 大豆異黃酮活性研究與應用[M]. 北京: 科學出版社, 2005: 170-178.

[7] CHIEN Hsiang-lin, HUANG Hui-yu, CHOU Cheng-chun. Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentation of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria[J]. Food Microbiology, 2006(23): 772-778.

[8] 高榮海, 趙秀紅, 鄭艷, 等. 大豆異黃酮糖苷和苷元免疫功能研究[J]. 糧油與油脂, 2008(7): 43-44.

[9] POLISELI-SCOPEL F H, HEMANDEZ-HERRERO M, GUAMIS B, et al. Sterilization and aseptic packaging of soymilk treated by ultra high pressure homogenization[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2014, 22(4): 81-88.

[10] KOBAYASHI A, TSUDA Y, HIRATA N, et al. Aroma constituents of soybean【Glycine max (L.) Merril.】milk lacking lipoxygenase isoenzymes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995, 43(9): 2 449-2 452.

[11] MATSUURA M, OBATA A, FUKUSHIMA D. Objectionable flavor of soy milk developed during the soaking of soybeans and its control[J]. Journal of Food Science, 1989, 54(3): 602-605.

[12] 劉肖南, 馬艷莉. 高效液相色譜法測定六種大豆異黃酮及雌馬酚的含量[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2012, 18(9): 58-61.

[13] 殷麗君, 李里特, 李再貴, 等. 采用HPLC技術(shù)快速檢測發(fā)酵大豆制品中異黃酮的含量[J]. 食品科學, 2002, 23(2): 100-103.

[14] VANDENDOOL H, KRATZ P D. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 1963, 11(2): 463-471.

[15] WANG Meng-fan, GUO Jian, WEI Qi, et al. An effective and green method for the extraction and purification of aglycone isoflavones from soybean[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22(3): 705-712.

[16] 田三德, 王東, 張煥民. 純大豆發(fā)酵豆乳的風味物質(zhì)與微觀結(jié)構(gòu)的初探[J]. 中國釀造, 2004(6): 8-9.

Effects of glycosidase(R.B1L and R.CL) on configuration of isoflavones and improvement of flavor in soybean milk

ZHOU Wei-jie1,2

XIARong3

ZHUChong-yang1,2

PEIJing4

TAOHui-yuan3

CHENGYong-qiang1,2

(1.BeijingKeyLaboratoryofFunctionalFoodfromPlantResources,Beijing100083,China;2.CollegeofFoodScience&NutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China;3.ZhenjiangHengshunBiologicalEngineeringCo.,LTD,Zhenjiang,Jiangsu212000,China;4.ActisEnzymesTrading(Shanghai)Co.,LTD,Shanghai200050,China)

In order to obtain a higher content of soybean isoflavone glycosides and improve the flavor of soybean milk, two kinds of glycosidase (R.B1L and R.CL) were used in soybean milk processing, then the soybean isoflavones and lavor compounds were detected by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry technique(GC/MS) respectively. The results showed that the amount of soybean isoflavone aglycones increased 7.289 μg/g, which was 35.7% higher than the control group. While, the bean flavor compounds of hexanal and 2-amyl furan decreased 10.8%, and the aroma compounds of hexyl alcohol and anti-2-nonene aldehyde increased 10.88%. It indicates that the glycosidase can provide a good method for improving the quality and flavor of soybean milk.

soybean milk; glycosidase; soybean isoflavones; flavor

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(編號：2014C10000308)；江蘇省重點研發(fā)計劃項目(編號：BE2015346)；“十二五”科技支撐計劃項目(編號：2014BAD04B06)

周煒杰，男，中國農(nóng)業(yè)大學在讀碩士研究生。

程永強(1972—)，男，中國農(nóng)業(yè)大學教授，博士。 E-mail：chengyq@cau.edu.cn

2016—08—09

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.001