冬小麥 miR398前體的克隆及其在低溫條件下對(duì)靶基因 CSD1表達(dá)的調(diào)控

梅 琳，徐慶華，蒼 晶，盧秋巍，于 晶，張 達(dá)，馮明芳，張舒馳，梁桂花，張 超

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理與分子生物學(xué)研究室，黑龍江哈爾濱 150030)

冬小麥 miR398前體的克隆及其在低溫條件下對(duì)靶基因 CSD1表達(dá)的調(diào)控

梅 琳，徐慶華，蒼 晶，盧秋巍，于 晶，張 達(dá)，馮明芳，張舒馳，梁桂花，張 超

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理與分子生物學(xué)研究室，黑龍江哈爾濱 150030)

miR398是受逆境脅迫負(fù)調(diào)控的miRNA，其靶基因CSD編碼超氧化物歧化酶(SOD)，使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。為進(jìn)一步了解低溫脅迫下 miR398的調(diào)控機(jī)制，從東農(nóng)冬麥1號(hào)中克隆小麥 miR398前體，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，用Real-time PCR檢測(cè)T0代植株中小麥 miR398及其靶基因 CSD1在低溫脅迫下的表達(dá)量。結(jié)果表明，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)， miR398表達(dá)下調(diào)、 CSD1基因表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為小麥 miR398能響應(yīng)低溫脅迫、負(fù)調(diào)控 CSD1基因表達(dá)，間接提高了擬南芥的抗寒性。

冬小麥； miR398； CSD1；抗寒性；表達(dá)調(diào)控

MicroRNAs(miRNAs)是一種重要的調(diào)控因子，在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[1]。在低溫脅迫下，miRNA不僅調(diào)控其靶基因，部分miRNA也直接參與了植物逆境脅迫應(yīng)答[2-3]。miRNA的調(diào)控機(jī)制取決于其與靶基因的堿基互補(bǔ)配對(duì)程度，如果miRNA與靶基因完全匹配，則該復(fù)合體降解mRNA；若兩者序列部分匹配，則通過(guò)抑制靶基因的翻譯來(lái)沉默特定基因[4]。

miR398參與植物逆境應(yīng)答[5]，并且在水稻和擬南芥中高度保守，暗示其可能在多種生物脅迫下都發(fā)揮調(diào)控作用[6]。已有研究表明， miR398是通過(guò)對(duì)其靶基因CSD(編碼Cu-Zn型超氧化物歧化酶)的剪切實(shí)現(xiàn)負(fù)向調(diào)控[7]。 miR398的靶基因CSD包括兩種類型，分別為細(xì)胞質(zhì) CSD1和葉綠體 CSD2[6]。已有相關(guān)研究報(bào)道， CSD1參與氧化應(yīng)激、銅離子、鹽脅迫以及細(xì)菌感染等脅迫過(guò)程的應(yīng)答，能夠一定程度消除脅迫中產(chǎn)生的活性氧[8]。過(guò)表達(dá)抗 miR398的 CSD2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中， CSD2的高表達(dá)會(huì)比正常情況下 CSD2的表達(dá)產(chǎn)生更多的 CSD2 mRNA，進(jìn)而提高植株對(duì)高光強(qiáng)、重金屬等逆境的抵抗力[9]。目前對(duì) miR398與其靶基因的研究主要集中在擬南芥、煙草等植物中，而在冬小麥中鮮有報(bào)道。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自主培育的東農(nóng)冬麥1號(hào)(Dongnongdongmai 1，簡(jiǎn)寫(xiě)為DN1)是首例能在黑龍江省高寒地區(qū)越冬(返青率85%以上)的強(qiáng)抗寒(可耐-30 ℃低溫)栽培品種。本研究室應(yīng)用Hiseq高通量技術(shù)構(gòu)建了DN1在5 ℃、-10 ℃和-25 ℃低溫脅迫下的miRNA庫(kù)，對(duì)其分析表明 miR398在5 ℃時(shí)表達(dá)量微弱，在-10 ℃時(shí)表達(dá)量升高，在-25 ℃時(shí)表達(dá)量最高[10]，但對(duì)低溫脅迫調(diào)控 miR398表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚[11]。為了明確 miR398與低溫脅迫的關(guān)系，需要利用生物信息學(xué)和生物學(xué)試驗(yàn)等方法尋找miRNA的靶基因[12]，并探索低溫下 miR398與靶基因的作用關(guān)系。植物中miRNA與靶基因之間幾乎是完全互補(bǔ)配對(duì)[4]，利用生物信息學(xué)篩選靶基因不僅可獲得大量候選靶基因，而且準(zhǔn)確率較高[13]。鑒于此，本研究以DN1為材料，克隆小麥 miR398前體( pre-tae-miR398)，在利用生物信息學(xué)方法篩選小麥 miR398靶基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化擬南芥，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中 miR398及其靶基因在低溫脅迫下的表達(dá)調(diào)控，初步明確DN1中 miR398與低溫脅迫的關(guān)系，以期為揭示miRNA調(diào)控DN1強(qiáng)抗寒性的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

強(qiáng)抗寒冬小麥品種DN1(東農(nóng)冬麥1號(hào))由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。擬南芥(ArabidopsisthalianaL.) Col(Columbia)生態(tài)型由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理與分子實(shí)驗(yàn)室提供。引物合成和測(cè)序均由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 冬小麥總DNA的提取

采用CTAB法提取DN1的分蘗節(jié)總DNA，用RNase I處理純化DNA。

1.2.2 pre-tae-miR398的PCR擴(kuò)增及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的冬小麥 miR398的前體序列[10]，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物P1/P2(表1)。以1.2.1中提取的總DNA為模板，以P1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所擴(kuò)增條帶特異性強(qiáng)，且與預(yù)期目的條帶大小一致，因此，在P1和P2引物的5′端分別加上含PacI酶切位點(diǎn)的特定序列g(shù)gcttaaU，重新合成引物P3/P4(表1)。以1.2.1中提取的總DNA為模板，以P3/P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用USERTM酶消化。參照Nour-Eldin等的方法[14]，采用Nt.BbvCI和PacI雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA3300(攜帶CaMV35s啟動(dòng)子)，酶切后的質(zhì)粒也用USERTM酶消化。然后，將USERTM酶消化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒經(jīng)回收、純化后進(jìn)行連接，獲得過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398。最后，將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性菌株，提取質(zhì)粒后測(cè)序鑒定。

PCR擴(kuò)增體系為20 μL,包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA模板0.8 μL、引物P3和P4各0.7 μL、1 U·μL-1Taq酶0.1 μL、ddH2O 14.1 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

酶切體系為100 μL，包括NEB4 10 μL、10×BSA 10 μL、pCAMBIA3300載體20 μL、ddH2O 58 μL、PacI和Nt.BbvCI各1 μL。酶切反應(yīng)條件：PacI加入后37 ℃反應(yīng)1 h，再加入Nt.BbvCI于37 ℃反應(yīng)1 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 農(nóng)桿菌侵入法轉(zhuǎn)化擬南芥及其低溫脅迫培養(yǎng)

將測(cè)序鑒定正確的pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，挑取陽(yáng)性克隆，菌落PCR鑒定。農(nóng)桿菌侵染擬南芥參照邱 礽等[16]的方法。野生型與轉(zhuǎn)化后的擬南芥置于4 ℃培養(yǎng)箱中，并分別于0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 后取葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Real-time PCR

按照Trizol說(shuō)明書(shū)中的方法提取擬南芥葉片的總RNA (寶生物工程有限公司，大連)。反轉(zhuǎn)錄總RNA (包含小RNA)用miRNA cDNA synthesis kit及Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(寶生物工程有限公司，大連)試劑盒，并按照操作說(shuō)明進(jìn)行。Real-time PCR利用STBR試劑盒(寶生物工程有限公司，大連)。miRNA的內(nèi)參基因?yàn)?U6，靶基因的內(nèi)參基因?yàn)锳ctin，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA樣品進(jìn)行歸一化，用2-△△Ct法分析。每個(gè)樣品做3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)反應(yīng)各設(shè)一個(gè)空白對(duì)照(cDNA模板空白)。各內(nèi)參基因引物見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物序列

Table 1 Primer sequences used in this study

引物名稱 Primername引物序列(5'-3') Primersequence(5'-3')P1AGACGCGAGGAAATTCCTGP2GCGAGGAGGCTCCAGCP3GGCTTAAUAGACGCGAGGAAATTCCTGP4GGCTTAAUGCGAGGAGGCTCCAGCP5ACACTCCAGCTGGGTGTGTTCTCAGGTCGP6CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGGGGGCG反向通用引物ReverseuniversalprimerTGGTGTCGTGGAGTCGU6-FATTGGAACGATACAGAGAAGATTU6-RGGAACGCTTCACGAATTTGP7TTCCGCCCAAGTCCGGATACGCP8GGTGGTCGGGCCATCTCCCTCGTGGGTActin-FCCTTAGTACCTTCCAACAGATGTActin-RCCAGACAACTCGCAACTTAGA

1.2.5 生物信息學(xué)分析

利用miRNA在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase (http://www.mirbase.org/search.shtml)篩選小麥miRNA。利用RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)分析miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNA-Target/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和Targetscan (http://genes.mit.edu/mirscan/)預(yù)測(cè)靶基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 pre-tae-miR398的克隆及 miR398的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室前期建立的DN1小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)(未發(fā)表)中 miR398的前體序列與miRNA在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase登錄的序列(MIPF0000107)一致。利用RNAfold預(yù)測(cè) miR398的前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，其能夠形成miRNA特有的頸環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1)。

利用引物P3/P4對(duì)DN1的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小約120 bp的單一條帶，且與預(yù)期目的片段大小一致(圖2)。將經(jīng)過(guò)酶切等處理的目的片段和pCAMBIA3300載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并從中隨機(jī)挑取8個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，送博仕生物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中 pre-tae-miR398序列的堿基序列同源性為100%，即獲得了pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398重組質(zhì)粒。通過(guò)三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析對(duì)比，參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值，篩選出匹配度相對(duì)較高的靶基因，并通過(guò)NCBI檢索確定 miR398的靶基因?yàn)?CSD1(DR735568)。

圖1 DN1中 miR398前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)

M:DL 20 bp DNA marker; 1: pre-tae-miR398的擴(kuò)增產(chǎn)物。

M:DL 20 bp DNA marker;1:Amplified products of wheat precursor gene ofmiR398.

圖2 DN1中 pre-tae-miR398的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 PCR product of wheat precursor gene ofmiR398 of DN1

2.2 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥及 miR398與其靶基因引物的驗(yàn)證結(jié)果

提取的pCAMBIA330035sU-pre-tae-miR398轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行PCR，引物為P1/P2(表1)，用4%的瓊脂糖凝膠電泳得到陽(yáng)性克隆產(chǎn)物(圖3)，并選取長(zhǎng)勢(shì)一致的擬南芥進(jìn)行侵染。根據(jù)miRNA特有的頸環(huán)結(jié)構(gòu)與其靶基因序列分別設(shè)計(jì)引物P5/P6和P7/P8(表1)，驗(yàn)證引物的特異性。以DN1的cDNA為模板，4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在80 bp處有一清晰的條帶，與預(yù)測(cè)的 miR398頸環(huán)法反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增大小一致(圖4A)，其靶基因也與預(yù)測(cè)的125 bp大小一致(圖4B)。

M:DL 20 bp DNA marker; 1～3:菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; CK:陰性對(duì)照。

M:DL 20 bp DNA marker; 1～3:Colony PCR amplification products; CK:Negative control.

圖3 重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌后的菌落PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 PCR analysis of recombinant plasmid

M:DL 20 bp DNA marker; 1: miR398引物的驗(yàn)證; 2:靶基因引物的驗(yàn)證。

M:DL 20 bp DNA marker; 1:Validation of miR398 primers; 2:Validation of target gene primers.

圖4 miR398(A)及其靶基因(B)引物的特異性檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 Specific detection of miR398 (A) and its target gene (B) primers

2.3 低溫脅迫下T0代 miR398前體轉(zhuǎn)化擬南芥植株的 miR398及 CSD1基因的表達(dá)

對(duì)野生型與轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株進(jìn)行4 ℃低溫脅迫，并檢測(cè)內(nèi)源及外源 miR398及靶基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明， pre-tae-miR398在CAM35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，且與靶基因隨低溫脅迫表現(xiàn)出規(guī)律性變化(圖5)。

以未轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥作為陽(yáng)性對(duì)照，0 h侵染為陰性對(duì)照，4 ℃處理不同時(shí)間后， miR398相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為先上升后下降(4 h除外)，并在12 h時(shí)達(dá)到峰值；其對(duì)應(yīng)的靶基因 CSD1在0～4 h 范圍內(nèi)的表達(dá)量逐漸升高，在6～24 h范圍內(nèi)的表達(dá)量與陰性對(duì)照相比逐漸降低，并都顯著低于 miR398的表達(dá)量，且于12 h表達(dá)量最低。12 h后隨著 miR398表達(dá)量的降低，其靶基因表達(dá)量逐漸升高， miR398在48 h表達(dá)量再次達(dá)到最低，而其靶基因 CSD1則達(dá)到峰值，表明 miR398對(duì)其靶基因 CSD1呈負(fù)調(diào)控。

圖5 野生型及過(guò)表達(dá) pre-tae-miR398植株的 miR398(A)及其靶基因(B)在4 ℃下的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

miR398是首個(gè)被報(bào)道的能夠響應(yīng)多種脅迫的miRNA[6]，在調(diào)節(jié)植物銅代謝平衡、應(yīng)答過(guò)量的重金屬脅迫以及臭氧、鹽害等非生物脅迫方面發(fā)揮作用。當(dāng)植物遭遇非生物脅迫時(shí)，為了保護(hù)膜組織免受傷害，體內(nèi)的SOD(超氧化物岐化酶)升高達(dá)到清除過(guò)量ROS的目的[17]。根據(jù)輔因子的不同，SOD分為Mn-SOD(MSD)、Cu/Zn-SOD(CSD)和Fe-SOD(FSD)三種類型，其中，CSD作為主要的SOD，在清除ROS的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。低溫和干旱脅迫對(duì)小麥CSD基因的表達(dá)影響不同。小麥MSD基因的表達(dá)受低溫和干旱誘導(dǎo)，但小麥CSD基因的表達(dá)只受低溫誘導(dǎo)[19]。蘇 群等[20]研究了外源SOD模擬物聚天冬氨酸鉀鹽(PASPK)對(duì)小油菜抗寒性的作用效果，結(jié)果表明，低溫脅迫下，外源SOD模擬物能夠促進(jìn)小油菜種子的萌發(fā)并明顯增強(qiáng)幼苗的抗寒性。轉(zhuǎn)豌豆葉綠體CSD在煙草中的過(guò)量表達(dá)可以提高植株對(duì)強(qiáng)光與低溫的耐受力[21]。

當(dāng)植物受到各種生物及非生物脅迫時(shí)， CSD1與 miR398始終表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的負(fù)調(diào)控關(guān)系[6]。但在擬南芥中 CSD2表達(dá)量在重金屬、甲基紫精和強(qiáng)光照的脅迫下增加[22]，而在臭氧和病菌的感染脅迫下減少[23]。Dugas等[24]發(fā)現(xiàn)了 miR398與靶基因新的調(diào)控機(jī)制，蔗糖能夠正調(diào)控 miR398的表達(dá)，并導(dǎo)致 CSD1與 CSD2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平降低，這表明不同脅迫刺激的 miR398表達(dá)不同，其參與逆境脅迫的機(jī)制十分復(fù)雜。

本研究表明，4 ℃冷處理下，在野生型與過(guò)表達(dá) miR398擬南芥植株中，隨著低溫脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)， miR398表達(dá)量逐漸升高之后降低，其靶基因 CSD1出現(xiàn)與之相反的表達(dá)模式，處理4 h時(shí) miR398表達(dá)量降低，靶基因 CDS1表達(dá)量升高，這可能與植物體對(duì)低溫信號(hào)識(shí)別、轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)級(jí)聯(lián)放大、響應(yīng)等一系列過(guò)程中存在某一特定應(yīng)激節(jié)點(diǎn)有關(guān)，4 h即是過(guò)表達(dá)植株快速應(yīng)答低溫脅迫的應(yīng)激節(jié)點(diǎn)。吳紹華等[25]在研究抗冷基因 HbMKK6時(shí)，在4 ℃處理抗寒品種橡膠樹(shù)4 h時(shí)， HbMKK6表達(dá)量最高。在低溫處理24 h后，由于過(guò)表達(dá) miR398可以增加植物對(duì)環(huán)境脅迫的靈敏度[26]，使其抗低溫脅迫，調(diào)節(jié)體內(nèi)相應(yīng)的生理生化功能，導(dǎo)致 CSD1表達(dá)上調(diào)。 CSD1的大量積累，可通過(guò)調(diào)節(jié)膜透性、增強(qiáng)膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，使植物細(xì)胞減少損傷，降低ROS對(duì)植物造成的傷害，此時(shí) CDS1表達(dá)量呈峰值。但隨著低溫脅迫的延長(zhǎng)，在低溫脅迫72 h后， CSD1的表達(dá)量下降，可能是由于植物有高度復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)和響應(yīng)低溫脅迫通路的共同作用，使體內(nèi)其他防御系統(tǒng)發(fā)揮作用[27]，也可能是由于隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，植物體受到的損害加劇，導(dǎo)致 CSD1 表達(dá)量的再次下降[28]。

從試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，在低溫脅迫下，過(guò)表達(dá) pre-tae-miR398植株通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因 CDS1來(lái)提高植物的抗寒性,與王健飛等[29]關(guān)于DN1低溫脅迫下miRNA表達(dá)模式的研究結(jié)果一致?？梢愿鶕?jù) miR398與 CSD1呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，對(duì)DN1中 miR398進(jìn)行沉默或者敲除，解除 miR398對(duì)靶基因的抑制提高植物的抗寒性。

[1]BARTEL D P.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions [J].Cell,2009,136(2):218.

[2]SUNKAR R,LI Y F,JAGADEESWARAN G.Functions of microRNAs in plant stress responses [J].TrendsinPlantScience,2012,17(4):32.

[3]AGARWAL V,BELL G W,NAM J W,etal.Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs [J].ElifeSciences,2015,4:e05005.

[4] 賀曉麗,劉 萍,欒雨時(shí).番茄 miR398 基因的克隆及其在煙草中的表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報(bào),2015,51(12):2164.

HE X L,LIU P,LUAN Y S.Cloning of tomato miR398 gene and its expression analysis in tobacco [J].PlantPhysiologyJournal,2015,51(12):2164.

[5]SUNKAR R,ZHU J K.Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs fromArabidopsis[J].PlantCell,2004,16(8):2001.

[6] 丁艷菲,王光鉞,傅亞萍,等. miR398 在植物逆境脅迫應(yīng)答中的作用[J].遺傳,2010,32(2):131.

DING Y F,WANG G Y,FU Y P,etal.Role of miR398 in plant stress responses [J].Hereditas,2010,32(2):131.

[7] 魯玉柱,封 振,邊黎穎,等.過(guò)表達(dá)抗 miR398 的 OsmCSD2基因提高水稻的重金屬抗性[J].植物生理學(xué)報(bào),2011,47(11):1065.

LU Y Z,FENG Z,BIAN L Y,etal.Over-expression of miR398-resistant version of OsmCSD2 gene in rice enhance tolerance to heavy metal stress [J].PlantPhysiologyJournal,2011,47(11):1065.

[8]TRINDADE I,CAPITO C,DALMAY T,etal. miR398 and miR408 are up-regulated in response to water deficit inMedicagotruncatula[J].Planta,2010,231(3):708.

[9]PARTELLI F L,VIEIRA H D,RODRIGUES A P D,etal.Cold induced changes on sugar contents and respiratory enzyme activities in coffee genotypes [J].CienciaRural,2010,40(4):783.

[10] 盧寶偉.東農(nóng)冬麥1號(hào)越冬期間的microRNA高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012:100.

LU B W.Solexa sequencing and bioinformation analysis of microRNA in winter wheat Dongnongdongmai 1 during overwintering period [D].Harbin:Northeast Agricultural University,2012:100.

[11] 王 星,劉肖飛,周宜君,等.植物SOD基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2014,36(2):279.

WANG X,LIU X F,ZHOU Y J,etal.Molecular mechanism of expression and regulation ofSODgene in plant [J].ChineseJournalofOilCropSciences,2014,36(2):279.

[12] 劉卓琦,萬(wàn)福生,羅達(dá)亞.miRNA靶基因的篩選方法及其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)資源[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2015,31(2):121.

LIU Z Q,WAN F S,LUO D Y.Methods and their online resources for miRNA targets screening [J].ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology,2015,31(2):121.

[13]RHOADES M W,REINHART B J,LIM L P,etal.Prediction of plant microRNA targets [J].Cell,2002,110(4):517.

[14]NOUR-ELDIN H H,HANSEN B G,N?RHOLM M H,etal.Advancing uracil-excision based cloning towards an ideal technique for cloning PCR fragments [J].NucleicAcidsResearch,2006,34(18):127.

[15] 王紅波,李 成,曹陽(yáng)理惠,等. CYP79F1基因?qū)ξ魈m花的遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J].植物研究,2014,34(4):518.

WANG H B,LI C,CAO Y L H,etal.Genetic transformation of CYP79F1 gene inBrassicaoleraceavar.italica[J].BulletinofBotanicalResearch,2014,34(4):518.

[16] 邱 礽,陶 剛,李奇科,等.農(nóng)桿菌滲入法介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)及應(yīng)用[J].分子植物育種,2009,7(5):1032.

QIU R,TAO G,LI Q K,etal.Transient gene expression mediated by agroinfiltration and its application [J].MolecularPlantBreeding,2009,7(5):1032.

[17]PITZSCHKE A,FORZANI C,HIRT H.Reactive oxygen species signaling in plants [J].ReactiveOxygenSpeciesinPlantSignaling,2006,8(9-10):1757.

[18] 姚 婕,趙艷玲.植物Cu,Zn-SOD分子調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,34(3):58.

YAO J,ZHAO Y L.Molecular regulation mechanism research progress on plant Cu,Zn-SOD [J].ChineseJournalofTropicalAgriculture,2014,34(3):58.

[19] 汪本勤.植物SOD的研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,12(3):6.

WANG B Q.The research progress of the plant SOD [J].JournalofHebeiAgriculturalSciences,2008,12(3):6.

[20] 蘇 群,張 彥,孫 磊.一種外源SOD模擬物對(duì)小油菜抗寒作用效果的研究[J].作物雜志,2012,27(2):94.

SU Q,ZHANG Y,SUN L.Study on the effect of exogenous SOD on the cold resistance ofBrassica[J].Crops,2012,27(2):94.

[21]DAS P,SENGUPTA K,DUTTA P,etal.Significance of cryptosporidium as an aetiologic agent of acute diarrhoea inCalcutta:a hospital based study [J].JournalofTropicalMedicine&Hygiene,1993,96(2):124.

[22]SUNKAR R,KAPOOR A,ZHU J K.Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes inArabidopsisis mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance [J].PlantCell,2006,18(8):2063.

[23]JAGADEESWARAN G,SAINI A,SUNKAR R.Biotic and abiotic stress down-regulate miR398 expression inArabidopsis[J].Planta,2009,229(4):1011.

[24]LECLERCQ J,MARTIN F,SANIER C,etal.Over-expression of a cytosolic isoform of theHbCuZnSODgene inHeveabrasiliensischanges its response to a water deficit [J].PlantMolecularBiology,2012,80(3):257.

[25] 吳紹華,陳月異,王建霄,等.巴西橡膠樹(shù) HbMKK6 基因的克隆及表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報(bào),2015,35(4):433.

WU S H,CHEN Y Y,WANG J X,etal.Cloning and expression analysis of a HbMKK6 gene in rubber tree(Heveabrasiliensis) [J].PlantPhysiologyJournal,2015,35(4):433.

[26]BAKHSHI B,FARD E M,HOSSEINI G.Evaluation of miR398 differential expression in rice under drought stress condition [J].MolecularBiology,2014,8(3):87.

[27]LU X,GUAN Q,ZHU J.Downregulation of CSD2by a heat-inducible miR398 is required for thermotolerance inArabidopsis[J].PlantSignaling&Behavior,2013,8(8):e24952-1.

[28] 朱 政,蔣家月,江昌俊,等.低溫脅迫對(duì)茶樹(shù)葉片SOD、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,38(1):24.

ZHU Z,JIANG J Y,JIANG C J,etal.Effects of low temperature stress on SOD activity,soluble protein content and soluble sugar content inCamelliasinensisleaves [J].JournalofAnhuiAgriculturalUniversity,2011,38(1):24.

[29] 王健飛,蒼 晶,于 晶,等.外源ABA對(duì)東農(nóng)冬麥1號(hào)miRNA表達(dá)模式的影響[J].麥類作物學(xué)報(bào),2014,34(3):315.

WANG J F,CANG J,YU J,etal.Effects of exogenous abscisic acid on miRNA expression pattern of winter wheat Dongnongdongmai 1 [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(3):315.

Cloning of Winter Wheat Pre- miR398 and Expression Analysis of Target Gene CSD1 under Cold Stress

MEI Lin,XU Qinghua,CANG Jing,LU Qiuwei,YU Jing,ZHANG Da,FENG Mingfang,ZHANG Shuchi,LIANG Guihua,ZHANG Chao

(Laboratory of Plant Physiology and Molecular Biology,School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

miR398 is a miRNA that is negatively regulated by the adversity. The target geneCSDencoding superoxide dismutase (SOD) can resist the toxicity of ROS in plants. In order to further understand the regulatory mechanism of miR398 under low temperature stress,the wheat miR398 precursor gene was cloned from Dongnongdongmai 1,and overexpression vector was conducted and transformed intoArabidopsisthaliana,and Real-time PCR was used to detect the expression level of miR398 and its target gene CSD1 in T0generation under cold stress.The results showed that miR398 of wheat responded to cold stress and down-regulated the expression of CSD1 inArabidopsis.With the extension of low temperature stress time,the expression of miR398 was down-regulated and the expression of CSD1 was up-regulated. It was suggested that the wheat miR398 could respond to low temperature stress and negatively regulate CSD1 gene expression,which indirectly enhanced the cold resistance ofArabidopsisthaliana.

Winter wheat; miR398; CSD1; Cold resistance; Gene expression regulation

時(shí)間：2016-11-04

2016-05-20

2016-10-17

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201418)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2012RCB102)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471423)；國(guó)家自然科學(xué)基金人才培養(yǎng)科研訓(xùn)練項(xiàng)目(J1210069)；國(guó)家自然科學(xué)基金人才培養(yǎng)條件建設(shè)項(xiàng)目(J1120002)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541002)

E-mail:283862466@qq.com

蒼 晶(E-mail:cangjing2003@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1419-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161104.0924.002.html