軟體動(dòng)物扇貝橫紋肌中類肌聯(lián)蛋白的純化

包玉龍，張三潤，薩日娜，鄭明霞，邢萬金，周好樂

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.鄂爾多斯市衛(wèi)生學(xué)校，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000；3.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022)

軟體動(dòng)物扇貝橫紋肌中類肌聯(lián)蛋白的純化

包玉龍1，張三潤1，薩日娜2，鄭明霞1，邢萬金3，周好樂1

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.鄂爾多斯市衛(wèi)生學(xué)校，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000；3.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022)

利用含1 mol/L尿素的0.15 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)從扇貝橫紋肌肌原纖維中提取了相對分子質(zhì)量為2.0×106的類肌聯(lián)蛋白.將類肌聯(lián)蛋白提取液添加到DEAE-TOYOPEARL 650M型層析柱，利用陰離子交換柱層析法對其進(jìn)行了純化，并利用共沉淀法研究了扇貝類肌聯(lián)蛋白與纖維型肌動(dòng)蛋白(F-actin)的相互作用.結(jié)果表明：纖維型肌動(dòng)蛋白不產(chǎn)生沉淀，但扇貝類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白產(chǎn)生共沉淀，類肌聯(lián)蛋白可能是存在于軟體動(dòng)物橫紋肌中的一種新型的肌聯(lián)蛋白樣蛋白.

軟體動(dòng)物；扇貝；肌聯(lián)蛋白樣蛋白；蛋白提?。坏鞍准兓?；蛋白相互作用

肌聯(lián)蛋白是相對分子質(zhì)量約為3.0×106的巨大彈性蛋白質(zhì)[1]，由1個(gè)分子連接肌小節(jié)的Z線到M線[2-3].肌聯(lián)蛋白的彈性與肌小節(jié)的結(jié)構(gòu)維持和被動(dòng)張力有關(guān)[4].這種彈性性質(zhì)與存在于肌小節(jié)I帶區(qū)域的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)結(jié)構(gòu)域、PEVK區(qū)域、特殊序列有關(guān)[2，5-7].

另一方面，在無脊椎動(dòng)物橫紋肌中從其一級結(jié)構(gòu)到抗體交叉反應(yīng)上，存在很多類似肌聯(lián)蛋白的肌聯(lián)蛋白樣蛋白(connectin-like protein).如線蟲TTN-1(C.elegansTTN-1)、小龍蝦凸出蛋白(crayfish projectin)、昆蟲凸出蛋白等[8-12].

在軟體動(dòng)物平滑肌中，在細(xì)肌絲(thin filament)與粗肌絲(thick filament)相互作用而產(chǎn)生收縮后，存在一種叫作捕捉(catch)的結(jié)構(gòu)，它能利用少量能量維持長時(shí)間的張力.這種狀態(tài)與相對分子質(zhì)量為53萬的肌聯(lián)蛋白樣蛋白顫搐蛋白(twitchin)有關(guān).貽貝顫搐蛋白的一級結(jié)構(gòu)已被確定，它是由24個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域和15個(gè)纖連蛋白3型(fibronectin type 3，F(xiàn)n)結(jié)構(gòu)域組成，在C末端附近存在1個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域.在肌小節(jié)中定位于粗肌絲，與肌球蛋白等粗肌絲組成的蛋白相結(jié)合[13-14].

到目前為止，軟體動(dòng)物肌聯(lián)蛋白樣蛋白，除了顫搐蛋白以外尚未有報(bào)道.關(guān)于軟體動(dòng)物橫紋肌收縮、舒展時(shí)肌小節(jié)結(jié)構(gòu)維持的機(jī)制尚不明確.在對扇貝橫紋肌全蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)在相對分子質(zhì)量為2.0×106(類肌聯(lián)蛋白)的位置出現(xiàn)了條帶，并與脊椎動(dòng)物肌聯(lián)蛋白抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng).因此，該蛋白可能是存在于軟體動(dòng)物中的新型的肌聯(lián)蛋白樣蛋白，可能對軟體動(dòng)物橫紋肌的結(jié)構(gòu)維持與被動(dòng)張力的產(chǎn)生起到?jīng)Q定性的作用.本實(shí)驗(yàn)對扇貝橫紋肌中存在的相對分子質(zhì)量為2.0×106的蛋白進(jìn)行提取純化，探討了該蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用.

1 材料與方法

1.1 材料

在蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)橫紋肌中提取扇貝類肌聯(lián)蛋白；在兔骨骼肌中提取球型肌動(dòng)蛋白.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SDS-PAGE和蛋白印記實(shí)驗(yàn)

SDS-PAGE采用Laemmli[15]的方法進(jìn)行，使用無濃縮膠的2.3%～4%，2%～15%，2%～6%的梯度凝膠，凝膠染色使用考馬斯亮藍(lán).

蛋白印記時(shí)，先用SDS-PAGE將蛋白質(zhì)分離后，再轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素(NC)膜上[16].使用含3%明膠(Gelatin)的TBS緩沖液(pH=7.5)將此膜封閉，使用含1%明膠的TBS緩沖液(pH=7.5)稀釋的一抗進(jìn)行反應(yīng).TBS緩沖液漂洗后，使用含1%明膠的TBS緩沖液(pH=7.5)稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng).用TBS緩沖液漂洗后，用3，3，-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色.

1.2.2 扇貝類肌聯(lián)蛋白的提取

在肌原纖維緩沖液(40 mmol/L KCl，5 mmol/L 磷酸鉀(pH=7.0)，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L EGTA)中將扇貝橫紋肌粉碎，5 000 r/min離心5 min，棄上清，此步反復(fù)6次，制備肌原纖維.然后用1 mmol/L NaHCO3將肌原纖維漂洗10 min，6 000 r/min離心10 min，棄上清，此步反復(fù)3次；待充分膨脹后，再用30 mmol/L NaCl漂洗10min，6 000 r/min離心10 min，棄上清.離心后的殘?jiān)?.1 mol/L磷酸鉀(pH=7.0)提取15 min，6 000 r/min離心20 min，棄上清液，保留殘?jiān)?用蒸餾水將此殘?jiān)?次，使殘?jiān)械碾x子強(qiáng)度降下來后，再用30 mmol/L NaCl洗滌3次.最后使用含1 mol/L尿素的0.15 mol/L磷酸鉀(pH =7.0)提取5 min，7 000 r/min離心20 min，得到的上清液即為扇貝類肌聯(lián)蛋白提取液.

1.2.3 扇貝類肌聯(lián)蛋白的純化

將扇貝類肌聯(lián)蛋白提取液添加到用0.15 mol/L磷酸鉀(含1 mol/L尿素，pH=7.0)平衡的DEAE-TOYOPEARL 650M(TOSOH)型層析柱，然后用0.25 mol/L磷酸鉀(含1 mol/L尿素，pH=7.0)洗脫，得到扇貝類肌聯(lián)蛋白的粗純化組分.

將得到的粗純化組分在含2 mol/L尿素的0.15 mol/L磷酸鉀(pH=7.0)中透析12 h，再度添加到用0.15 mol/L磷酸鉀(含2 mol/L尿素)平衡的DEAE-TOYOPEARL 650M(TOSOH)型層析柱中，用含2 mol/L尿素的0.25 mol/L磷酸鉀緩沖液洗脫，得到扇貝類肌聯(lián)蛋白的純化組分.

1.2.4 共沉淀實(shí)驗(yàn)

將扇貝類肌聯(lián)蛋白純化組分經(jīng)0.15 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)透析一夜后，13 000 r/min離心20 min，取上清液作為類肌聯(lián)蛋白使用.對上清液進(jìn)行BCA法蛋白濃度測定，其質(zhì)量濃度為228 mg/mL.肌聯(lián)蛋白和肌動(dòng)蛋白物質(zhì)的量比約為1∶190，因此肌動(dòng)蛋白的質(zhì)量濃度為160 mg/mL，應(yīng)混合的肌聯(lián)蛋白質(zhì)量濃度為60 mg/mL.但實(shí)驗(yàn)中考慮到扇貝類肌聯(lián)蛋白純化物中的雜質(zhì)蛋白較多，估算扇貝類肌聯(lián)蛋白約占1/3，因此用扇貝類肌聯(lián)蛋白原始的質(zhì)量濃度228 mg/mL和肌動(dòng)蛋白質(zhì)量濃度160 mg/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn).將類肌聯(lián)蛋白(228 mg/mL)和肌動(dòng)蛋白(160 mg/mL)在45 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)、10 mmol/L KCl 24℃條件下反應(yīng)1 h；13 000 r/min，離心30 min，分離上清和沉淀，用2%～15%的梯度凝膠進(jìn)行分離觀察.

2 結(jié)果

2.1 扇貝橫紋肌蛋白的提取

利用2.3%～4.0%梯度凝膠分離的扇貝橫紋肌全蛋白提取物的結(jié)果表明，相對分子質(zhì)量2.0×105以上的位置出現(xiàn)了4個(gè)條帶.相對分子質(zhì)量約為2.0×106的蛋白為類肌聯(lián)蛋白，相對分子質(zhì)量為5.3×105的蛋白為顫搐蛋白，其他蛋白尚不清楚(見圖1A).

使用脊椎動(dòng)物肌聯(lián)蛋白單克隆抗體(Mc3Bq)進(jìn)行的蛋白印記結(jié)果表明，相對分子質(zhì)量5.3×105的顫搐蛋白和類肌聯(lián)蛋白產(chǎn)生了交叉反應(yīng)，但與類肌聯(lián)蛋白的反應(yīng)較弱(見圖1B).

2.2 扇貝類肌聯(lián)蛋白的提取

從0.15 mol/L磷酸鉀(含1 mol/L尿素，pH=7.0)溶液提取的類肌聯(lián)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果可以看出，扇貝類肌聯(lián)蛋白提取液中除了類肌聯(lián)蛋白以外還含有大量的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等其他蛋白質(zhì)(見圖2).

圖1 扇貝橫紋肌全蛋白提取液的SDS-PAGE和蛋白印跡

圖2 扇貝類肌聯(lián)蛋白提取液SDS-PAGE

2.3 扇貝類肌聯(lián)蛋白的純化

使用陰離子交換柱層析法對類肌聯(lián)蛋白進(jìn)行第一次純化的結(jié)果表明，用0.25 mol/L磷酸鉀(含1 mol/L尿素，pH=7.0) 階段洗脫后，出現(xiàn)了明顯的洗脫高峰.對純化的各組分進(jìn)行的SDS-PAGE結(jié)果顯示，流出液當(dāng)中沒有出現(xiàn)扇貝類肌聯(lián)蛋白的條帶，說明扇貝類肌聯(lián)蛋白被層析柱充分吸附.而在洗脫峰d點(diǎn)的洗脫液中出現(xiàn)了較粗的扇貝類肌聯(lián)蛋白條帶，說明得到了較高濃度的扇貝類肌聯(lián)蛋白的粗純化組分.但其粗純化組分中混有較多的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白(見圖3A).

A第一次柱層析；B第二次柱層析

為了去除扇貝類肌聯(lián)蛋白粗純化組分中的雜質(zhì)蛋白，進(jìn)行第二次柱層析.結(jié)果表明，在利用含0.25 mol/L磷酸鉀(pH=7.0)洗脫時(shí)，出現(xiàn)了洗脫峰，對其洗脫組分進(jìn)行的SDS-PAGE結(jié)果顯示，各洗脫組分均含有較高濃度的扇貝類肌聯(lián)蛋白，但仍混有少量的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，未能將其完全除去(見圖3B).

2.4 扇貝類肌聯(lián)蛋白與纖維型肌動(dòng)蛋白的結(jié)合性

T 未離心；S 上清液；P 沉淀圖4 扇貝類肌聯(lián)蛋白與肌動(dòng)蛋白的共沉淀實(shí)驗(yàn)

將得到的類肌聯(lián)蛋白純化組分與兔骨骼肌的纖維型肌動(dòng)蛋白進(jìn)行共沉淀實(shí)驗(yàn).SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，僅對纖維型肌動(dòng)蛋白離心分離后，纖維型肌動(dòng)蛋白大部分在上清中可見；僅對類肌聯(lián)蛋白離心分離后，類肌聯(lián)蛋白有近一半在上清，另一半存在于沉淀；而對類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白反應(yīng)后的混合物進(jìn)行分離后，纖維型肌動(dòng)蛋白和類肌聯(lián)蛋白幾乎都存在于沉淀中(見圖4).這表明，纖維型肌動(dòng)蛋白和類肌聯(lián)蛋白發(fā)生了結(jié)合.

3 討論

扇貝類肌聯(lián)蛋白難溶于鹽，在不用尿素的條件下提取量非常少，因此，在提取時(shí)加入了尿素，以得到高濃度的類肌聯(lián)蛋白(見圖2).在加入1 mol/L和2 mol/L尿素的實(shí)驗(yàn)條件下，未發(fā)現(xiàn)差異，所以本實(shí)驗(yàn)使用了較低濃度的1 mol/L尿素進(jìn)行提取.在提取類肌聯(lián)蛋白時(shí)加入尿素使得類肌聯(lián)蛋白的提取量大大增加，但同時(shí)其他蛋白的提取量也隨之增加，所以進(jìn)行柱層析時(shí)出現(xiàn)了阻塞的現(xiàn)象，因此，使用10倍體積的液體量進(jìn)行提取，使類肌聯(lián)蛋白的提取量增加的同時(shí)，降低了其他蛋白的濃度，解決了層析柱阻塞的問題.SDS-PAGE的結(jié)果顯示，在類肌聯(lián)蛋白提取液中除了類肌聯(lián)蛋白以外還混有肌球蛋白等多種蛋白質(zhì)，但通過初次的陰離子交換柱層析法去除了大量的雜質(zhì)蛋白(見圖3A).在粗純化組分中，除了類肌聯(lián)蛋白以外還有未能去除的肌球蛋白等.因此，對粗純化組分再度利用柱層析進(jìn)行了純化.再度純化時(shí)，為了降低蛋白間的相互作用，在加入了2 mol/L尿素的0.15 mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)中進(jìn)行12 h的透析.在加入2 mol/L尿素的條件下，再度進(jìn)行陰離子交換柱層析，得到了類肌聯(lián)蛋白的純化組分(見圖3B).與加入1 mol/L尿素的條件下進(jìn)行的柱層析相比較，不附著于樹脂柱的肌球蛋白的量增加，洗脫出的類肌聯(lián)蛋白的比例增加.

為闡明扇貝類肌聯(lián)蛋白的性質(zhì)，我們研究了類肌聯(lián)蛋白與肌動(dòng)蛋白間的相互作用.因?yàn)轭惣÷?lián)蛋白純化組分中含有尿素，使用不含尿素的溶液(0.15 mol/L 磷酸鉀，pH=7.0)進(jìn)行透析后，進(jìn)行了結(jié)合實(shí)驗(yàn).類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白可相互結(jié)合(見圖5).結(jié)合的原因可能是：(1)類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白直接結(jié)合；(2)類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白通過與類肌聯(lián)蛋白純化組分中未被去除的肌球蛋白相互作用而結(jié)合.我們的結(jié)果雖然不能否定類肌聯(lián)蛋白純化組分中未能完全去除的肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相互作用而產(chǎn)生沉淀，但從類肌聯(lián)蛋白純化組分中含有的肌球蛋白的量與類肌聯(lián)蛋白相比其量較少，與類肌聯(lián)蛋白的沉淀和纖維型肌動(dòng)蛋白的沉淀相比較，類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白混合反應(yīng)后，兩者的沉淀比例明顯增加，表明類肌聯(lián)蛋白和纖維型肌動(dòng)蛋白極可能是直接相結(jié)合的.

綜上所述，扇貝類肌聯(lián)蛋白與顫搐蛋白一樣可以和肌動(dòng)蛋白相互作用.軟體動(dòng)物中存在的顫搐蛋白已證實(shí)是與肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白相互作用的肌聯(lián)蛋白樣蛋白.本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，扇貝類肌聯(lián)蛋白與顫搐蛋白一樣具有與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的能力.因此類肌聯(lián)蛋白可能是存在于軟體動(dòng)物橫紋肌中的一種新型的肌聯(lián)蛋白樣蛋白.有關(guān)該蛋白的一級結(jié)構(gòu)及其在肌原纖維中的定位，以及進(jìn)一步證明該蛋白是軟體動(dòng)物橫紋肌中的一種新型的肌聯(lián)蛋白樣蛋白還需更深入的研究.

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(責(zé)任編輯：方 林)

Purification of similar-connectin in scallop striated muscle

BAO Yu-long1，ZHANG San-run1，Sarina2，ZHENG Ming-xia1，XING Wan-jin3，ZHOU Hao-le1

(1.College of Basic Medical，Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010059，China；2.Erdos Health School，Erdos 017000，China；3.College of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010022，China)

The similar-connectin was extracted with 0.15 mol/L buffer of potassium phosphate(pH=7.0)，in which 1 mol/L urea was added，from the scallop striated myofibrils.Then the supernatant containing the similar-connectin was loaded onto DEAE-Toyopearl 650M column( anion exchange column chromatography)，the protein was purified.Finally，tested the interaction of the similar-connectin on F-actin with co-sedimentation assay.The results showed that F-actin alone did not precipitate，but when similar-connectin was added in，F(xiàn)-actin co-precipitated with the similar-connectin，indicating that similar-connectin may be a new type of connectin-like protein in scallop striated muscle.

mollusks；scallop；connetin-like protein；protein extraction；protein purification；protein interaction

1000-1832(2016)04-0111-05

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.04.024

2015-10-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31460600)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014MS08106).

包玉龍(1976—)，男，博士研究生，講師，主要從事分子細(xì)胞生物學(xué)研究；通訊作者：周好樂(1962—)，女，教授，主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究.

Q 952 [學(xué)科代碼] 180·5727

A