金屬離子對噻嗪酮與小牛胸腺DNA相互作用的影響

朱娜，何婭梅，梁棟，桑楠*

（1.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，太原 030006；2.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原 030051）

金屬離子對噻嗪酮與小牛胸腺DNA相互作用的影響

朱娜1，何婭梅1，梁棟2，桑楠1*

（1.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，太原 030006；2.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原 030051）

為探討噻嗪酮及金屬離子共存對非靶標(biāo)生物遺傳毒性的機(jī)制，利用紫外、熒光光譜法研究生理?xiàng)l件下噻嗪酮與小牛胸腺DNA（ctDNA）之間的結(jié)合作用大小及模式，從分子水平上分析了Cd2+、Co2+、Cu2+、Ni2+存在時對噻嗪酮與ctDNA相互作用的影響。結(jié)果表明：噻嗪酮可與ctDNA結(jié)合引起噻嗪酮吸收光譜明顯紅移；可與亞甲基藍(lán)（MB）競爭結(jié)合ctDNA，且結(jié)合常數(shù)K隨溫度升高呈遞減趨勢；可與ctDNA以嵌插方式結(jié)合使熔點(diǎn)明顯升高。環(huán)境金屬離子的存在不會改變噻嗪酮與ctDNA之間的作用模式，但會影響其結(jié)合強(qiáng)弱，低濃度Cu2+、Ni2+可通過離子橋表現(xiàn)出一定的促結(jié)合作用，高濃度時則引起DNA結(jié)構(gòu)改變而削弱噻嗪酮與DNA的結(jié)合，Co2+、Cd2+能影響DNA分子結(jié)構(gòu)、與噻嗪酮競爭結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)下降。

噻嗪酮；金屬離子；ctDNA；熒光光譜

對糧食與農(nóng)業(yè)安全的憂慮迫使甲胺磷、久效磷、對硫磷等高毒農(nóng)藥退出市場，更多的低毒特效產(chǎn)品逐漸成為主流藥物，而濫用農(nóng)藥導(dǎo)致的藥物殘留也帶來新的環(huán)境風(fēng)險。噻嗪酮（Buprofezin）是一種噻二嗪類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，對同翅目的飛虱、葉蟬、粉虱及介殼蟲類害蟲有特效，在水稻、茶葉、柑橘、棉花、蔬菜等作物病蟲害防治中發(fā)揮著重要作用，屬高效低毒殺蟲劑[1-2]。目前全國每年噻嗪酮原藥總設(shè)計(jì)產(chǎn)能8000 t左右，實(shí)際總產(chǎn)量4500t，且呈逐年遞增趨勢[3]。

據(jù)報道菊酯類和噻嗪酮?dú)埩粼谖覈隹诓枞~超標(biāo)農(nóng)藥中位居前列[4]。南京地區(qū)茶葉在用藥7 d后仍殘留約10 mg·kg-1[5]；北京和山東等地番茄與種植土中也發(fā)現(xiàn)噻嗪酮的殘留[6]；長沙、杭州、貴陽等地柑橘生產(chǎn)中，噻嗪酮用藥的安全期均在14 d以上[7]。西班牙Almeria地區(qū)蔬菜大棚中胡椒、扁豆和茄子等也檢測到噻嗪酮的殘留[8]。因此，應(yīng)對噻嗪酮引起非靶標(biāo)生物暴露的環(huán)境安全風(fēng)險引起重視。

重金屬含量超標(biāo)也是出口農(nóng)產(chǎn)品中與農(nóng)藥殘留伴生的主要問題之一，浙江省地方綠茶噻嗪酮?dú)埩糇罡哌_(dá)600 μg·kg-1，鮮樣中Cu、Cd的平均濃度分別為12.5 mg·kg-1和0.24 mg·kg-1[9-10]。越南湄公河的農(nóng)業(yè)沉積物中不僅發(fā)現(xiàn)521 μg·kg-1的噻嗪酮，同時也檢出Ni、Cu、Co等金屬并存[11]；印度與羅馬尼亞的葡萄種植園也分別發(fā)現(xiàn)了噻嗪酮和重金屬殘留[12-13]。這些研究結(jié)果表明，農(nóng)產(chǎn)品中金屬與新型農(nóng)藥殘留形成的復(fù)合污染已成為非靶標(biāo)生物環(huán)境暴露及健康風(fēng)險的重要形式。

流行病學(xué)研究表明，在非職業(yè)暴露人群血清樣本中噻嗪酮檢出率超出50%[14]；噻嗪酮證實(shí)可干擾哺乳動物細(xì)胞有絲分裂[15]，引起雄鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞染色體畸變[16]；金屬離子也會參與到DNA與藥物的識別和結(jié)合過程，對DNA的結(jié)構(gòu)與功能造成損傷[17]。本文以亞甲基藍(lán)（MB）為分子探針，通過紫外、熒光光譜法研究生理?xiàng)l件下噻嗪酮與DNA結(jié)合模式，同時選取與DNA結(jié)合強(qiáng)度不同的4種典型金屬離子（Cd2+、Co2+、Cu2+、Ni2+），探討重金屬對噻嗪酮與DNA結(jié)合作用的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：CARY Eclipse 960型熒光分光光度計(jì)（Varian），U-3900紫外可見分光光度計(jì)（Hitachi），HH-2型恒溫水浴槽（國華電器）。

試劑：小牛胸腺DNA（Solarbio，ctDNA），用0.1 mol·L-1NaCl配制，利用ε=6600 L·mol-1·cm-1確定溶液濃度為1.89×10-4mol·L-1，溶液存于4℃?zhèn)溆?。噻嗪酮（以下簡稱Bup）使用無水乙醇配制成濃度為4.92× 10-2mol·L-1貯備液。亞甲基藍(lán)（MB）使用三蒸水配制成濃度為1×10-3mol·L-1貯備液。金屬離子（Ni2+、Cu2+、Co2+、Cd2+）均使用三蒸水配制成濃度為4.92×10-2mol· L-1貯備液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噻嗪酮-ctDNA紫外光譜測定

在10 mL比色管中，固定Bup的濃度為4.0×10-5mol·L-1，分別加入不同體積的ctDNA溶液（終濃度范圍為6.0×10-5～1.0×10-4mol·L-1），Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，混勻后靜置5 min。掃描200～350 nm紫外吸收光譜，并扣除背景空白。

1.2.2 噻嗪酮、金屬離子對MB-ctDNA熒光光譜的影響

在10 mL比色管中，固定MB和ctDNA的濃度（CMB=1.0×10-5mol·L-1，CDNA=1.89×10-5mol·L-1），分別加入不同體積的Bup溶液（終濃度范圍為4.92×10-6～ 4.43×10-5mol·L-1）或金屬離子溶液（終濃度范圍為2.46×10-6～2.21×10-5mol·L-1），Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，混勻后靜置5 min。以630 nm為激發(fā)波長，掃描650～750 nm熒光光譜，并分別記錄25、31、37℃熒光強(qiáng)度變化。

1.2.3 金屬離子對噻嗪酮與MB-ctDNA體系結(jié)合常數(shù)的影響

在10 mL比色管中，固定MB、ctDNA和金屬離子濃度（CMB=1×10-5mol·L-1，CDNA=1.89×10-5mol·L-1，CMetal=2.46×10-6mol·L-1），改變體系中Bup濃度（終濃度范圍為4.92×10-6～4.43×10-5mol·L-1），Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，混勻后靜置5 min，記錄熒光強(qiáng)度變化。依次改變體系中金屬離子濃度（2.46×10-6～ 3.69×10-5mol·L-1），分別記錄熒光強(qiáng)度變化。

1.2.4 ctDNA熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

分別移取ctDNA溶液、Bup-ctDNA、Bup-ctDNAMetal溶液于比色杯中，濃度依次為CDNA=5×10-5mol· L-1，CBup=4×10-5mol·L-1，CMetal=7.38×10-5mol·L-1，利用紫外分光光度計(jì)記錄20～95℃范圍內(nèi)溶液在260 nm處的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 ctDNA對噻嗪酮紫外光譜的影響

在pH為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，噻嗪酮的最大紫外吸收峰為246 nm，此吸收帶主要由噻嗪酮分子結(jié)構(gòu)中含硫氮的芳香雜環(huán)π-π*躍遷所引起。隨著體系中ctDNA濃度的增加，最大吸收波長逐漸紅移到257 nm，同時也呈現(xiàn)明顯的增色效應(yīng)（圖1），說明噻嗪酮與ctDNA之間發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Bup-ctDNA二元體系在最大吸收峰處的吸光度顯著低于單一噻嗪酮與ctDNA吸光度之和，由此可推斷加入ctDNA后，噻嗪酮與DNA發(fā)生結(jié)合并可能形成基態(tài)復(fù)合物，改變了原有分子結(jié)構(gòu)中的紫外吸收官能團(tuán)[18]。

圖1 ctDNA對噻嗪酮紫外光譜的影響Figure 1 The absorption spectra of buprofezin in the presence of ctDNA

2.2 噻嗪酮對MB-ctDNA熒光光譜增強(qiáng)機(jī)制及二元結(jié)合常數(shù)

亞甲基藍(lán)（MB）是一種典型的熒光探針，可與DNA以嵌插方式結(jié)合。因?yàn)猷玎和陨頍晒廨^弱，無法直接通過熒光光譜法研究二者作用方式，所以選擇MB為熒光探針，間接考察農(nóng)藥與DNA之間的相互作用。在MB溶液中加入ctDNA后，前者的熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯降低（圖2），表明MB-ctDNA體系中由于電子間相互作用引起激發(fā)態(tài)發(fā)光團(tuán)結(jié)構(gòu)變化而導(dǎo)致熒光猝滅現(xiàn)象的發(fā)生。MB-ctDNA體系中加入不同濃度噻嗪酮時，其熒光譜圖如圖2所示。隨著噻嗪酮濃度的增加，體系發(fā)生了明顯的增色效應(yīng)。這是溶液中游離態(tài)MB的量增加所導(dǎo)致的[19]，分析可能是由于噻嗪酮結(jié)構(gòu)中有與MB相似的不飽和平面芳環(huán)和堿性亞氨基側(cè)鏈，能參與競爭MB在ctDNA上的結(jié)合位點(diǎn)，致使部分結(jié)合到ctDNA上的MB釋放出來，體系熒光增強(qiáng)。

根據(jù)熒光增強(qiáng)效應(yīng)公式：

圖2 噻嗪酮對MB-ctDNA熒光光譜的影響Figure 2 Fluorescence spectra of MB-ctDNA in the presence of buprofezin

式中：F0和Fx分別表示未加入和加入噻嗪酮時體系的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)∞為噻嗪酮與DNA相互作用的熒光強(qiáng)度最高值，K為結(jié)合常數(shù)，[Q]為噻嗪酮濃度。

使用不同溫度下加入噻嗪酮后體系熒光強(qiáng)度變化值1/（Fx-F0）對1/［Q］作圖，由回歸方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)K值并列于表1中。比較發(fā)現(xiàn)，不同溫度下結(jié)合常數(shù)K隨溫度升高而略有降低，推斷噻嗪酮可能與MB競爭結(jié)合DNA位點(diǎn)，但隨著體系溫度升高，二者結(jié)合形成的基態(tài)復(fù)合物穩(wěn)定度下降致使K值降低，故該過程應(yīng)屬于靜態(tài)結(jié)合[21]。

表1 不同溫度下噻嗪酮與MB-ctDNA結(jié)合常數(shù)Table 1 The binding constants for the system of buprofezin and ctDNA in different temperatures

2.3 金屬離子對噻嗪酮與MB-ctDNA結(jié)合的影響

前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)金屬離子、噻嗪酮單獨(dú)存在時均未與MB發(fā)生結(jié)合。固定MB-ctDNA體系中金屬離子濃度，通過調(diào)節(jié)噻嗪酮濃度可得到三元體系熒光光譜（圖3），結(jié)果表明：在Cu2+、Ni2+的存在下，噻嗪酮與MB-ctDNA體系的熒光增強(qiáng)效應(yīng)顯著，而Co2+、Cd2+存在下，多元體系的熒光強(qiáng)度變化減弱。實(shí)驗(yàn)還比較了不同金屬離子單獨(dú)存在時MB-ctDNA體系熒光強(qiáng)度變化（圖3）。通過熒光強(qiáng)度變化值1/（Fx-F0）對1/［Q］作圖，分別計(jì)算了金屬離子與MB-ctDNA的結(jié)合常數(shù)K值（表2）。金屬離子可通過配位作用與DNA雙螺旋內(nèi)側(cè)的堿基和電子基團(tuán)發(fā)生不同程度的結(jié)合[22]，隨著體系中金屬離子濃度的增大，部分結(jié)合的MB游離出來而增強(qiáng)了體系的熒光強(qiáng)度。

為了進(jìn)一步探討在復(fù)雜環(huán)境中不同金屬離子對噻嗪酮與MB-ctDNA結(jié)合作用的影響，分別采集了4種金屬在不同濃度條件下的三元體系熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)熒光增強(qiáng)公式計(jì)算了噻嗪酮與MB-ctDNA體系的結(jié)合常數(shù)，如圖4所示。結(jié)果表明：少量Cu2+可能先與噻嗪酮絡(luò)合，再通過離子橋作用與DNA的磷酸基團(tuán)結(jié)合[23]，形成DNA-Bup-Cu2+的復(fù)合物，使結(jié)合常數(shù)明顯增大；隨著Cu2+濃度的增加，由于形成DNA-Bup-Cu2+復(fù)合物的空間位阻效應(yīng)以及使DNA結(jié)構(gòu)松散的鹽效應(yīng)，不利于噻嗪酮與DNA的結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)略有下降[24]。

表2 不同金屬離子與MB-ctDNA結(jié)合常數(shù)（K）Table 2 The binding constants for the systems of Cd2+/Co2+/Cu2+/ Ni2+and MB-ctDNA

圖3 金屬離子存在對Bup-MB-ctDNA及MB-ctDNA體系熒光光譜的影響Figure 3 The effects of Cd2+，Co2+，Cu2+，Ni2+on the fluorescence spectra of Bup-MB-ctDNA and MB-ctDNA，respectively

圖4 金屬離子存在對Bup與MB-ctDNA結(jié)合常數(shù)的影響Figure 4 Effects of metal ions on the binding constant of buprofezin and MB-ctDNA

低濃度的Ni2+可使噻嗪酮與MB-ctDNA體系的結(jié)合常數(shù)有所上升，而高濃度的Ni2+會使之下降。這是由于Ni2+的結(jié)合位點(diǎn)為DNA的磷酸根骨架，噻嗪酮與少量Ni2+協(xié)同配合，可增加農(nóng)藥分子與DNA的結(jié)合量；高濃度的Ni2+則會滲透到DNA的堿基對中，與胸腺嘧啶的N3和鳥嘌呤的N1結(jié)合，造成DNA磷酸骨架和堿基破壞，進(jìn)而影響噻嗪酮與DNA的結(jié)合[25]。對于Co2+、Cd2+來說，二者均能減弱噻嗪酮與MB-ctDNA間的結(jié)合，且K值隨濃度增加而降低。這是由于低濃度的Co2+、Cd2+可能與DNA磷酸基團(tuán)上的氧原子配位，中和磷氧負(fù)離子，使得DNA分子結(jié)構(gòu)收縮，不利于噻嗪酮嵌插到DNA堿基對中；高濃度時則對DNA堿基表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，可能會與噻嗪酮競爭DNA嘌呤堿基上的N7結(jié)合位，導(dǎo)致其結(jié)合常數(shù)降低[26]。

2.4 金屬離子存在下噻嗪酮對ctDNA熔點(diǎn)的影響

藥物與DNA結(jié)合方式的差異，會產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，也能直接影響DNA的熔點(diǎn)。如以溝槽或靜電作用與DNA結(jié)合的藥物不會影響DNA熔點(diǎn)，但是藥物分子若以嵌插方式結(jié)合，則會使DNA的熔點(diǎn)上升5～8℃[27]。通過測定ctDNA、噻嗪酮-ctDNA和噻嗪酮-ctDNA-金屬離子體系的熔點(diǎn)（Tm值），即DNA變性達(dá)到50%時的溫度[28]，可以間接確定噻嗪酮與DNA的結(jié)合模式以及金屬離子的影響。

根據(jù)fss（fss=At/A20，其中At和A20分別為t℃和20℃時體系的吸光度）與溫度響應(yīng)關(guān)系分別測得DNA、Bup-ctDNA和Bup-ctDNA-Metal不同體系Tm值，見表3。結(jié)果表明，ctDNA熔點(diǎn)為75.0℃，當(dāng)加入噻嗪酮后，二元體系熔點(diǎn)升至80.8℃，而加入不同金屬離子后三元體系熔點(diǎn)溫度與二元體系相比變化不大。由此判定，噻嗪酮與ctDNA之間的結(jié)合方式為嵌插作用，4種金屬離子的存在并不影響噻嗪酮與ctDNA的結(jié)合模式。

表3 不同體系中ctDNA熔點(diǎn)比較Table 3 The melting properties of ctDNA，Bup-ctDNA and Bup-ctDNA-Metal

3 結(jié)論

紫外實(shí)驗(yàn)顯示隨著ctDNA濃度變化，噻嗪酮吸收光譜呈現(xiàn)出明顯的增色效應(yīng)，這提示二者之間有較強(qiáng)的相互作用，并可能通過形成二元復(fù)合物引起吸收帶紅移。MB熒光探針和DNA熔點(diǎn)實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證明噻嗪酮與DNA之間主要發(fā)生嵌插作用。環(huán)境中金屬離子的存在并未改變噻嗪酮與DNA之間的作用模式，少量Cu2+、Ni2+可能與DNA的磷酸根結(jié)合并通過離子橋協(xié)助噻嗪酮與ctDNA的作用，使結(jié)合常數(shù)呈現(xiàn)一定的增強(qiáng)，但高濃度時所形成的復(fù)合物可能影響到DNA的空間結(jié)構(gòu)，削弱噻嗪酮與DNA的結(jié)合；Co2+、Cd2+與DNA的配位不僅能改變DNA的分子結(jié)構(gòu)，而且可與噻嗪酮競爭結(jié)合DNA上的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)發(fā)生明顯下降。

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Interaction properties of buprofezin to calf thymus DNA in the presence of metal ions

ZHU Na1,HE Ya-mei1,LIANG Dong2,SANG Nan1*

（1.Environmental and Resource College,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.School of Chemical and Environmental Engineering, North University of China,Taiyuan 030051,China）

To illustrate the genetic toxicity mechanism of thiadiazine pesticides on non-target organisms,the interaction between buprofezin and calf thymus DNA（ctDNA）in vitro was investigated by UV-vis absorption spectroscopy and fluorescent spectrometry.The influences of heavy metals（Cd2+,Co2+,Cu2+and Ni2+）on the binding properties were also studied at the molecular level,using methylene blue（MB）as a probe of DNA.The results showed that there was a distinct red shift of absorption spectrum by addition of ctDNA which can be ascribed to the binding interaction between buprofezin and ctDNA.Fluorescent experiments indicated that buprofezin was bound to ctDNA in competition with MB,and the binding constants decreased as a function of temperature.Furthermore,DNA melting-point increment suggested that the binding of buprofezin to ctDNA was an intercalative mode.The presence of metal ions did not change the interaction mode between buprofezin and ctDNA,but influenced the binding intensity of buprofezin to ctDNA.A small quantity of Cu2+and Ni2+showed a promotion between buprofezin and ctDNA via an ionic-bridge mechanism,but a large quantity of ions would modify the structure of ctDNA and weaken the binding capacity.Meanwhile,Co2+and Cd2+could penetrate the ctDNA and competitively bind to ctDNA,resulting in the declination of binding constant.

buprofezin;metal ions;ctDNA;fluorescence spectrum

X171.5

A

1672-2043（2016）12-2314-06

10.11654/jaes.2016-0737

朱娜，何婭梅，梁棟，等.金屬離子對噻嗪酮與小牛胸腺DNA相互作用的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2016,35（12）：2314-2319.

ZHU Na,HE Ya-mei,LIANG Dong,et al.Interaction properties of buprofezin to calf thymus DNA in the presence of metal ions[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（12）：2314-2319.

2016－05－30

國家青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21407101，21406211）；國家留學(xué)基金委公派訪學(xué)項(xiàng)目（201508140049，201608140020）

朱娜（1980—），女，副教授，從事環(huán)境化學(xué)分析與生態(tài)毒理研究。E－mail：zhuna＠sxu．edu．cn

*通信作者：桑楠E－mail：sangnan＠sxu．edu．cn