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    微生物轉(zhuǎn)化去氫表雄酮生成7琢 15琢—二羥基雄烯醇酮的研究

    2016-12-27 11:02蔣衛(wèi)敏
    關(guān)鍵詞:投料菌體底物

    蔣衛(wèi)敏

    摘 要:7α,15α-二羥基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中間體,應(yīng)用亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini AS 3.4486)的羥化酶體系對去氫表雄酮(DHEA)底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,合成7α,15α-二羥基雄烯醇酮。文章采用平板篩選、投料方法、發(fā)酵過程的控制,在去氫表雄酮(DHEA)投料濃度10 g/L的條件下,轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上,主要產(chǎn)物為7α,15α-二羥基雄烯醇酮。比原來的投料濃度有較大的提高。

    關(guān)鍵詞:去氫表雄酮;亞麻刺盤孢;7α,15α-二羥基去氫表雄酮;微生物轉(zhuǎn)化工藝

    中圖分類號:R977.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1006-8937(2016)33-0211-03

    1 概 述

    隨著甾體化學(xué)的飛速發(fā)展,甾體激素類藥物已逐漸成為醫(yī)藥領(lǐng)域的重要門類。屈螺酮是一種高效、低毒、副作用小的新一代女用避孕藥。由于屈螺酮具有廣闊的市場前景,其前體化合物7α,15α-二羥基去氫表雄酮也受到廣泛關(guān)注。之前合成7α,15α-二羥基雄烯醇酮主要使用化學(xué)方法,由于化學(xué)法合成7α,15α-二羥基雄烯醇酮步驟繁瑣,產(chǎn)物收率低,對人和環(huán)境影響大。

    20世紀(jì)70年代德國先令首先將生物轉(zhuǎn)化法用于屈螺酮的合成,利用微生物的羥化酶體系,在去氫表雄酮的C7和C15位引入羥基,得到7α,15α-二羥基去氫表雄酮,再經(jīng)化學(xué)法合成屈螺酮。使用微生物法引入羥基縮短了屈螺酮的合成路線,但其轉(zhuǎn)化效率較低。目前對去氫表雄酮轉(zhuǎn)化效率比較高的菌株主要來自Colletotrichum lini屬,但高濃度的DHEA對具有菌種具有毒害作用,因此尋找耐受性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高、生命力強(qiáng)的菌種非常重要。

    由于絲狀真菌的細(xì)胞壁成份復(fù)雜,直接以孢子或菌絲進(jìn)行誘變比較難。本實(shí)驗(yàn)通過孢子稀釋培養(yǎng)篩選生長速度快的菌種,選擇加料溶劑、以及添加表面活性劑和各種轉(zhuǎn)化條件的控制,達(dá)到最佳培養(yǎng)條件以提高投料濃度和轉(zhuǎn)化率。

    2 材料與方法

    2.1 菌 種

    亞麻刺盤孢由本實(shí)驗(yàn)室保存

    2.1.2 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基PDA(g/L):土豆200,葡糖糖20,瓊脂20,pH自然

    種子(發(fā)酵)培養(yǎng)基(g/L):葡糖糖30,玉米漿10,磷酸二氫鉀1,磷酸氫二鉀2,硫酸鎂0.244,泡敵適量

    2.1.3 試 劑

    DHEA,7α,15α-二羥基去氫表雄酮,7α-羥基去氫表雄酮由本實(shí)驗(yàn)室分離制備。培養(yǎng)基各種營養(yǎng)成分購置上海試劑公司,投料使用的各種溶劑為工業(yè)級,分析使用試劑均為分析純。

    2.1.4 使用儀器

    菌種培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司SPX-150B-Z型),恒溫?fù)u床(上海世平的SPH-211C),臺式離心機(jī)(TGL-16C高速離心機(jī)),立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安LDZX-75KBS),菌種保藏(杭州華日電冰箱股份有限公司),超凈工作臺(蘇州凈化有限公司),顯微鏡, 高效液相色譜。

    2.2 試驗(yàn)方法

    2.2.1 生長速率快菌種篩選

    PDA培養(yǎng)基的配置,土豆去皮稱取200 g,切成小塊置燒杯中加水1 000 ml,煮沸5~10 min,用紗布濾去土豆塊,加水補(bǔ)充蒸發(fā)水分,加入20克葡萄糖和20克瓊脂溶解,分裝滅菌。滅菌之后均勻的傾到于平皿,冷卻凝固,28 ℃培養(yǎng)2天備用。取保存菌種用無菌水洗下孢子,吸取1 ml加入到裝有9 ml無菌水的試管中,為101,混合均勻之后按同樣方法稀釋,直至1010,取104~108每級涂布5個平皿,29 ℃培養(yǎng)。

    2.2.2 生長速度快菌株的擴(kuò)培

    選擇平皿中生長速度快,顏色深的菌落,擴(kuò)培到茄形瓶中,29 ℃培養(yǎng),待種子成熟之后,保存于冰箱。

    2.2.3 孢子懸浮液的培養(yǎng)

    將無菌水加入亞麻刺盤孢霉菌茄形瓶保藏培養(yǎng)基中,用接種環(huán)輕輕刮取表層孢子,將洗下的孢子懸浮液置于無菌的盛有玻璃珠的三角瓶內(nèi),打散孢子懸浮液約20 min。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液的濃度。將計(jì)數(shù)后的懸浮液于4 ℃冰箱內(nèi)保藏。盡量保證優(yōu)化過程中每瓶菌種生長狀態(tài)一致。

    2.2.4 亞麻刺盤孢生長曲線的測定

    采用過濾法測定菌體的生物量。取24個容量為500 ml的搖瓶,注明培養(yǎng)時(shí)間,分別準(zhǔn)確加入100 ml種子培養(yǎng)液,120 ℃滅菌30 min。接種前置無菌室開紫外燈30 min,向每瓶培養(yǎng)基中分別加入1 ml孢子懸浮液,29 ℃、160 rpm/min培養(yǎng)。

    從開始培養(yǎng)每隔4 h取2瓶,用恒重的濾紙抽濾菌體,至真空抽不在滴水,棄去濾紙稱其重量即為菌體的重量。取2瓶的平均值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),菌體量為縱坐標(biāo),得到亞麻刺盤孢的生長曲線。

    2.2.5 種子液的培養(yǎng)

    按種子培養(yǎng)基配方配置種子培養(yǎng)基,分裝于500 ml搖瓶中,每瓶裝200 ml , 塞紗布之后包牛皮紙,120 ℃滅菌30 min,冷卻。

    無菌條件下接種亞麻刺盤孢。

    29 ℃、160 rpm/min培養(yǎng)。

    2.2.6 投料前培養(yǎng)

    按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配置發(fā)酵培養(yǎng)基,分裝于500 ml搖瓶中,每瓶裝200 ml,塞紗布之后包牛皮紙,120 ℃滅菌30分鐘,冷卻。待種子液生長到一定間段,且生長良好,無雜菌。在無菌條件下將種子液按10%的量移種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,置搖床29 ℃180 r/min培養(yǎng)。

    2.2.7 投料時(shí)間的確定

    移種之后,由生長曲線觀察,觀察菌絲生長良好,鏡檢無雜菌,分別在對數(shù)生長期、穩(wěn)定前期、穩(wěn)定中期、穩(wěn)定后期、衰亡期投料。底物用溶劑(水、甲醇、乙醇、DMF)混合投料。

    2.2.8 投料量的確定

    分別考察投料量為2 g/l、4 g/l、6 g/l、8 g/l、10 g/l、12 g/l、14 g/l。每個投料量考察2個搖瓶。

    2.2.9 投料溶劑及倍率的考察

    分別考察溶劑為水、甲醇、乙醇、DMF。選擇最優(yōu)條件后,考察不同倍率投料,

    2.2.10 分析方法

    發(fā)酵液混合均勻,取1 ml發(fā)酵液離心,棄去上清,菌絲加入乙酸乙酯,萃取離心取上清檢測。檢測方法采用高效液相色譜(HPLC)檢測DHEA、7α-OH-DHEA、7α,15α-二羥基去氫表雄酮的濃度。

    Agilent C18柱,流動相乙腈:水=7:3,柱溫30 ℃,檢測波長206,進(jìn)樣量為10微升,流速0.5 ml/min.產(chǎn)物計(jì)算方法=7α,15α-二羥基去氫表雄酮峰面積/DHEA、7α-OH-DHEA、7α,15α-二羥基去氫表雄酮峰面積。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

    3.1 菌種篩選

    由于菌種生長時(shí)間較長,培養(yǎng)基滅菌之后倒于平皿之時(shí),需要稍微增加平皿中種子培養(yǎng)基的量,以保證培養(yǎng)后期培養(yǎng)基不會因缺水開裂。

    菌種篩選過程簡單,但工作量大,且不能保證篩選的菌種能夠長期穩(wěn)定的遺傳,需要不斷的進(jìn)行篩選,待選擇最佳的培養(yǎng)菌種為止。

    3.2 菌體生長曲線的測定

    制備亞麻刺盤孢孢子懸浮液,接種至種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)。通過不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體稱重,計(jì)算生物量,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),菌體量為縱坐標(biāo),得到生長曲線如圖1所示

    由圖1觀察得到,亞麻刺盤孢生長基本呈現(xiàn)潛伏期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的趨勢。接種后(0)-(6)h為菌體生長潛伏期,(6)-(18)為對數(shù)生長期,(18)-(36)為穩(wěn)定期,(36)達(dá)到最大生物量為31 g/L,之后進(jìn)入衰亡期。

    3.3 投料時(shí)間的確定

    選擇在不同時(shí)期投料,取樣檢測至底物不在消耗為止。以投料時(shí)期為橫坐標(biāo),轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo),如圖2所示

    如圖2所示,選擇在對數(shù)中后期菌體生長12 h左右投料較佳,轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%,加底物后繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。最優(yōu)選擇為生長至12 h投料。

    3.4 不同投料溶劑的影響

    甾體微生物轉(zhuǎn)化的一個主要問題是底物和產(chǎn)物在水溶液中的溶解度較低,且底物會被析出產(chǎn)物包裹,影響底物和菌種的接觸,限制最終的轉(zhuǎn)化。使用溶劑加吐溫投料不但可以使底物在水溶液中的溶解度變大,而且溶劑能夠增加菌體細(xì)胞膜的通透性,使底物和酶系更容易接觸。

    實(shí)驗(yàn)中使用水、甲醇、乙醇、DMF等生產(chǎn)中比較常見的溶劑??瞻讓φ諡椴患尤軇?,以溶劑為橫坐標(biāo),轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)得到如圖3所示。

    以不同溶劑投料,可得到最優(yōu)溶劑為DMF其轉(zhuǎn)化率達(dá)81%,這是由于物料在DMF中溶解性大,DMF本身對菌體的毒害性較小,故其轉(zhuǎn)化效果更好,而甲醇與乙醇對菌體有一定的毒害性,會影響菌體生長,水做溶劑時(shí)原料溶解性較差不能有效的與菌絲體接觸。

    3.5 不同投料濃度的影響

    選擇不同投料量,以投料量為橫坐標(biāo),轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)作圖。得到如圖4所示,最優(yōu)選擇為10 g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)84%。投料濃度越低轉(zhuǎn)化率越高,但投料濃度過低,降解很嚴(yán)重,最后產(chǎn)物也被降解了,收率比較低。當(dāng)投料量達(dá)到10 g/L時(shí)候,通過加入表面活性劑等方法仍然可以達(dá)到轉(zhuǎn)化80%以上。

    當(dāng)投料量過大時(shí),底物會抑制菌體生長,且對酶有抑制作用;而且過多底物會在發(fā)酵液中結(jié)團(tuán)存在,導(dǎo)致菌絲體無法利用底物;底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物后析出由于發(fā)酵液中底物濃度過高,產(chǎn)物就會在包裹底物形成顆粒,影響轉(zhuǎn)化。

    3.6 投料溶劑倍率考察

    選擇投料溶劑為DMF,依次選擇比例為0、1%、2%、3%、4%、5%(按照裝液量計(jì)算)。每批次2個搖瓶。500ml帶刺三口瓶裝液量100ml,以溶劑量為橫坐標(biāo),轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)做圖。如圖5所示。

    最優(yōu)選擇為2%,轉(zhuǎn)化率達(dá)83%。雖然DMF的溶解性較大且毒性較小,但當(dāng)溶劑量過少時(shí)仍有部分底物未溶解,造成轉(zhuǎn)化未完全;但溶劑量過大時(shí),也會對菌絲體造成損傷,不利于菌絲體生長及轉(zhuǎn)化。

    4 結(jié) 語

    通過一系列的條件考察,我們最終以葡糖糖30,玉米漿10,磷酸二氫鉀1,磷酸氫二鉀2,硫酸鎂0.244,泡敵適量(不起泡沫即可)為培養(yǎng)基,最優(yōu)培養(yǎng)條件為:種子培養(yǎng)條件29℃,

    160 rpm/min,發(fā)酵培養(yǎng)條件29 ℃,180 rpm/min,最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為:種子培養(yǎng)30~36 h,發(fā)酵培養(yǎng)為10%移種量培養(yǎng)12~18 h,生長良好,無雜菌使用2倍DMF投料。最終通過亞麻刺盤孢轉(zhuǎn)化DHEA生成目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上。且工藝穩(wěn)定,通過比例放大驗(yàn)證工藝可行,適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

    參考文獻(xiàn):

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