番紅花球莖組培中的消毒和褐化抑制方法

袁校文，項會敏，朱夢夢，蘇永君，田長城 (蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233000)

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番紅花球莖組培中的消毒和褐化抑制方法

袁校文，項會敏，朱夢夢，蘇永君，田長城*(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233000)

[目的] 優(yōu)化番紅花球莖消毒和褐化抑制的方法。[方法] 以番紅花球莖的染菌率、褐化率和愈傷組織誘導(dǎo)率為指標，分析了外植體大小、氯化汞濃度和消毒時間對番紅花球莖染菌和誘導(dǎo)的影響，同時比較了抗壞血酸和活性炭對番紅花球莖褐化的抑制效果。[結(jié)果] 當外植體大小5 mm3，氯化汞溶液濃度0.2%、消毒時間10 min時，染菌率和誘導(dǎo)率較為適宜；向培養(yǎng)基中加入0.5 g/L活性炭可以降低球莖的褐化。[結(jié)論]該研究建立了番紅花球莖消毒和褐化抑制方法，為野外番紅花球莖的初代組培提供了理論依據(jù)。

番紅花；球莖；消毒；褐化

番紅花(CrocussativuslL.)為鳶尾科番紅花屬多年生草本植物，又名藏紅花、西紅花，原產(chǎn)于西班牙、希臘、南歐以及伊朗等地，經(jīng)印度傳入我國，目前我國江浙和華北地區(qū)均有栽培[1]。番紅花可作為調(diào)味劑、香料和染料，其花柱中富含藏紅花酸(crocetin)和藏紅花素(crocin)等活性成分，具有活血化瘀、舒經(jīng)理絡(luò)、消腫止痛等功效，在我國傳統(tǒng)和現(xiàn)代醫(yī)藥中具有廣泛的應(yīng)用[2]。

番紅花的種植主要依靠球莖進行無性繁殖，多次分球種植后，球莖中積累了大量的病毒和微生物，極大地影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]。為了解決此問題，研究者以番紅花球莖為外植體進行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織和叢生芽[4-6]。在實際工作中，野外來源球莖外植體的高染菌率和褐化是妨礙球莖組培順利進行的2個棘手問題。筆者以染菌率、褐化率和愈傷組織誘導(dǎo)率作為評價標準，分析了不同因素對番紅花球莖組培中染菌及褐化的影響，以期尋求一種有效地抑制番紅花球莖染菌和褐化的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和6-芐胺基腺嘌呤(6-BA)購自國藥集團；其他化學(xué)試劑均為化學(xué)純。番紅花球莖購自浙江省湖州市種植基地。

1.2 方法

1.2.1球莖的預(yù)處理。 去除番紅花球莖外的皮膜，用自來水沖洗6 h，去除病斑后，無菌水浸泡10 min，濾紙濾干后置入2 %的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，無菌水洗滌4～6次，濾紙吸干表面水分，備用。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA[7]。每瓶2個外植體，每個處理40瓶。培養(yǎng)溫度為(23±2)℃，光照時間為12 h/d。計算外植體的染菌率、褐化率和愈傷組織誘導(dǎo)率，計算公式：

染菌率=(染菌個數(shù)/接種個數(shù))×100%

褐化率=(褐化個數(shù)/接種個數(shù))×100%

愈傷組織誘導(dǎo)率=(愈傷組織發(fā)生個數(shù)/接種個數(shù))×100%

1.2.2染菌的抑制方法。

1.2.2.1外植體大小的影響。 將球莖切成2、5和10 mm3的塊狀體，置入70%乙醇溶液中10 s，分別用質(zhì)量濃度0.2%的氯化汞溶液消毒10 min，無菌水洗滌5次，每次5 min，濾紙吸干后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，統(tǒng)計染菌率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2.2氯化汞濃度的影響。將球莖切成5 mm3的塊狀體，置入70%乙醇溶液中10 s，分別用質(zhì)量濃度0.1%、0.2%和0.3%的氯化汞溶液消毒10 min，無菌水洗滌5次，每次5 min，濾紙吸干后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，統(tǒng)計染菌率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2.3消毒時間的影響。將球莖切成5 mm3的塊狀體，置入70%乙醇溶液中10 s，分別用質(zhì)量濃度0.2%氯化汞溶液消毒5、10、15和20 min，無菌水洗滌5次，每次5 min，濾紙吸干后接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，統(tǒng)計染菌率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3褐化的抑制方法。

1.2.3.1抗壞血酸的抑制作用。 將球莖切成5 mm3的塊狀體，置入70%乙醇溶液中10 s，用質(zhì)量濃度0.2%氯化汞溶液消毒10 min,無菌水洗滌5次，吸干表面水分,分別用0.5、1.0和2.0 mg/ml的抗壞血酸溶液(無菌水配制)浸泡5、10和15 min，然后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。設(shè)置空白組，統(tǒng)計外植體的褐化率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3.2活性炭的抑制作用。將球莖切成5 mm3的塊狀體，置入70%乙醇溶液中10 s，用質(zhì)量濃度0.2%氯化汞溶液消毒10 min，無菌水洗滌5次，吸干表面水分，接入分別加入0、0.5、1.0和2.0 g/L活性炭的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，統(tǒng)計外植體的褐化率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體大小的影響由圖1可知，番紅花球莖外植體具有較高的染菌率，且隨著外植體體積的增大，球莖外植體染菌率逐漸升高。在第30天時，5 mm3外植體的染菌率為35%，愈傷組織誘導(dǎo)率為40%，優(yōu)于其他試驗組。

圖1 外植體大小對染菌和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 氯化汞濃度的影響由圖2可知，氯化汞質(zhì)量濃度與染菌率呈顯著的負相關(guān)；當其濃度為0.2%時，球莖的誘導(dǎo)率最高，是較理想的消毒濃度。

圖2 氯化汞濃度對染菌和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 消毒時間的影響由圖3可知，利用氯化汞消毒時，消毒時間對染菌率的影響很大。當消毒時間為5 min時，染菌率達60%，進而造成了較低的誘導(dǎo)率。當消毒時間在10 min以上時，染菌率基本保持不變，但誘導(dǎo)率隨消毒時間延長呈顯著的負相關(guān)。因此，采用0.2%的氯化汞溶液對番紅花外植體消毒10 min較為合適。

圖3 消毒時間對染菌和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 抗壞血酸對褐化的影響利用抗壞血酸溶液預(yù)處理番紅花球莖，不同濃度和處理時間下球莖的褐化情況見表1。由表1可知，1.0 mg/mL抗壞血酸溶液浸泡球莖30 min，褐化率和誘導(dǎo)率分別為10.0%和45.0%，顯著優(yōu)于未處理組。

表1 抗壞血酸對番紅花球莖褐化的影響

2.5 活性炭對褐化的影響由圖4可知，培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭可以顯著降低褐化的發(fā)生，同時促進愈傷組織的發(fā)生。

圖4 活性炭對番紅花球莖褐化的影響

3 結(jié)論與討論

球莖是一種節(jié)間縮短膨大為球形的肉質(zhì)地下變態(tài)莖，多為植物的無性繁殖器官。由于球莖深植于土壤中，含有大量的病毒和微生物。在利用野外球莖作為外植體進行組培時，有效的消毒方法成為試驗成功的關(guān)鍵步驟。外植體消毒多利用一些化學(xué)試劑，如氯化汞、次氯酸鈉、抗生素和乙醇等。在消除外植體表面微生物時，消毒劑對外植體細胞也具有破壞作用[8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，乙醇或氯化汞均會破壞原球莖的葉綠體，導(dǎo)致外植體黃化。因此，外植體消毒時要選擇合適的消毒劑，同時要控制消毒劑濃度和消毒時間，兼顧染菌率和誘導(dǎo)率。

在植物組培過程中，消毒劑的使用、培養(yǎng)基的組分以及植物自身的特性均會誘導(dǎo)褐化的發(fā)生。褐化會降低植物細胞的活力，影響愈傷組織的形成。研究表明，在培養(yǎng)基中添加適量抗壞血酸(0.01～0.20 mg/L)可以降低褐化的發(fā)生率[9]。值得注意的是，加入抗壞血酸的培養(yǎng)基進行高壓滅菌后，膠凝劑(瓊脂)難以凝固。劉真華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，蝴蝶蘭組培過程中，活性炭的添加可以有效控制褐化發(fā)生，同時促進外植體的生長，與該研究結(jié)果一致。

[1] 劉輝輝，毛碧增.藏紅花藥理作用及組織培養(yǎng)研究進展[J].藥物生物技術(shù)，2014，21(6)：593-596.

[2] 鄧穎，郭志剛，曾兆麟，等.藏紅花的藥理研究進展[J].中國中藥雜志，2002，27(8)：565-568.

[3] 李軍，高廣春，李白，等.植物組培脫毒技術(shù)及其在藥用植物藏紅花中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2014(7)：44-48.

[4] 陳書安，王曉東，歐陽杰，等.藏紅花球莖愈傷組織快速誘導(dǎo)的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38(4)：254-256.

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[7] 袁麗紅，陸玉婷，黃晶.藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)和褐化抑制[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2009，31(6)：22-26.

[8] 劉麗娟，李紅梅，劉雪蓮.不同處理方法對外植體消毒效果比較研究[J].北方園藝，2009(10)：86-87.

[9] 李麗，張湮帆，何康，等.兩種紅豆杉植物的愈傷組織培養(yǎng)及褐化抑制[J].復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，45(6)：702-707.

[10] 劉真華，葛紅，郭紹霞，等.蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中的褐化控制研究[J].園藝學(xué)報，2005，32(4)：732-734.

Methods for Disinfection and Browning Inhibition ofCrocussativusL. Corm in Tissue Culture

YUAN Xiao-wen, XIANG Hui-min, ZHU Meng-meng, TIAN Chang-cheng*et al (Department of Biology and Food, Bengbu College, Bengbu, Anhui 233000)

[Objective] To optimize the methods for disinfection and browning inhibition ofCrocussativusL. corm. [Method] With contamination rate, browning rate and callus induction rate ofC.sativuscorm as the indexes, we analyzed the effects of explant size, HgCl2concentration and disinfection time on the contamination and induction of corm. Meanwhile, the inhibition effects of ascorbic acid and active carbon on the browning of the corm were compared, respectively. [Result] The contamination rate and the callus induction rate were suitable under the conditions of 5 mm3explant size, 0.2% HgCl2concentration and 10 min disinfection time. The browning rate of the corm was lowered as the active carbon (0.5 g/L) was added into the culture medium. [Conclusion] The methods for disinfection and browning inhibition provide certain practical evidence for the original tissue culture of wildC.sativuscorm.

CrocussativusL.; Corm; Disinfection; Browning

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(AH201411305063)。

袁校文(1992- )，男，安徽安慶人，本科生，專業(yè)制藥工程。*通訊作者，講師，博士，從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏研究。

2016-09-21

S 504.3

A

0517-6611(2016)30-0108-02