晚期糖基化終末產物通過氧化應激誘導大鼠軟骨細胞損傷*

黃文舟， 王麗麗， 殷嫦嫦， 李 健， 敖 鵬， 程細高△

(1南昌大學第二附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌330006； 2九江學院/九江市轉化醫(yī)學重點實驗室，江西 九江 332000)

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晚期糖基化終末產物通過氧化應激誘導大鼠軟骨細胞損傷*

黃文舟1， 王麗麗2， 殷嫦嫦2， 李 健1， 敖 鵬1， 程細高1△

(1南昌大學第二附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌330006；2九江學院/九江市轉化醫(yī)學重點實驗室，江西 九江 332000)

目的：探討晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)能否通過氧化應激引起大鼠軟骨細胞損傷。方法:原代培養(yǎng)SD大鼠軟骨細胞，對細胞表型進行鑒定；應用CCK-8法檢測軟骨細胞生存率；DCFH-DA染色熒光顯微鏡下檢測胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平；Hoechst 33342 核染色法及Annexin V-FITC/PI流式細胞法測定軟骨細胞的凋亡率；RT-PCR法檢測軟骨細胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、MMP3、MMP13和COL2的mRNA水平；Western blotting法檢測軟骨細胞中cleaved caspase-3、MMP3、MMP13和COL2的蛋白水平。結果:與對照組相比，AGEs可顯著上調胞內ROS水平(P<0.05)，但經抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制后ROS的生成明顯減少(P<0.05)；另外，NAC可抑制AGEs引起的軟骨細胞凋亡相關分子Bax/Bcl-2和caspase-3水平的上調，并減少MMP3和MMP13表達及COL2的丟失(P<0.05)。結論:AGEs可通過氧化應激誘導大鼠軟骨細胞損傷。

晚期糖基化終末產物； 骨性關節(jié)炎； 氧化應激； 基質金屬蛋白酶； 細胞凋亡

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關節(jié)軟骨退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯耐诵行约膊　ｊP節(jié)軟骨主要由軟骨細胞(chondrocyte)和軟骨基質(extracellular matrix，ECM)組成，其中軟骨細胞對維持細胞外基質的完整性具有重要作用[1]。正常情況下，軟骨細胞對細胞外基質的合成和降解一直處于動態(tài)平衡。OA中，軟骨細胞凋亡是導致OA的直接原因。此外，軟骨細胞分泌蛋白水解酶增加，通過對Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等細胞外基質的降解作用，打破了這種動態(tài)平衡，引起關節(jié)軟骨完整性的破壞，最終促進骨性關節(jié)炎的形成[2]。 OA是一個多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的結果，其主要與衰老、肥胖程度、機械因素及基因表達遺傳因素等有關，其中衰老是導致OA的主要原因[3]。 氧化應激與衰老所致的骨性關節(jié)炎密切相關[4]。然而，衰老引起氧化應激所導致OA發(fā)病的原因尚不明確。近來，晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)被認為是衰老致OA患病的分子學基礎[5]。AGEs主要通過引起軟骨基質降解與軟骨細胞凋亡[6-7]、促進軟骨組織的炎癥反應等[8]方式在OA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究通過研究AGEs 促進氧化應激對大鼠關節(jié)軟骨細胞損傷的作用，探討AGEs在骨性關節(jié)炎發(fā)病過程中的作用，對早期預防及治療OA提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物及材料

SPF級雄性SD大鼠，4周齡，體重約40 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(湘)2014-0004。AGE-BSA(Calbiochem)；胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)；Ⅱ型膠原酶、蘇木素染液、甲苯胺藍染液和Alcian Blue 8GX(Solarbio)；Hoechst 33342染色液、活性氧檢測試劑盒和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購自Beyotime；小鼠IgG免疫組化試劑盒和DAB顯色液(Boster)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(MultiSciences Biotech)；蛋白提取試劑盒(Applygen)；CCK-8試劑盒和GREENspin細胞RNA 快速提取試劑盒(Zomanbio)；HiFiScript 快速去基因組cDNA 第1鏈合成試劑盒、DNA Ladder2000及高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒(Cwbio)；2× Taq Master Mix(Sinobio)；抗cleaved caspase-3抗體(CST)；抗MMP3和抗MMP13抗體(Novus)；抗Ⅱ型膠原和抗GAPDH抗體(Abcam)；山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(Proteintech)；所用引物由上海生工合成，見表1。

2 方法

2.1 大鼠關節(jié)軟骨細胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定 取4周齡SPF級大鼠，頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡30 min，消毒后無菌操作分離股骨頸、股骨踝和脛骨平臺，取關節(jié)軟骨并剪碎收集于離心管中，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃水浴消化30 min，離心去除液體，加入0.2% II型膠原酶37 ℃水浴振蕩消化3 h，離心收集細胞，含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打重懸混勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，以后每3～4 d更換培養(yǎng)基，待細胞鋪滿瓶底80% 以上，使用0.25%胰酶消化細胞，按1∶2培養(yǎng)傳代。取第3代細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁以后進行Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色、甲苯胺藍染色和阿爾新藍染色。

表1 引物序列

2.2 AGEs對大鼠軟骨細胞生存率的影響 取第3代軟骨細胞，以每孔5×103接種于96孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；吸除培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度AGEs的DMEM培養(yǎng)基(不含胎牛血清)100 μL，藥物濃度分別為0、10、25、50、100、200 mg/L。每組設5個復孔，分別培養(yǎng)24 h及48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。計算每組藥物濃度組吸光值的平均值，分別與空白對照組比較。

2.3 細胞分組及處理 取第3代軟骨細胞進行實驗，分組如下：空白對照(control)組：只加DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)軟骨細胞24 h；AGEs組：含AGEs的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h；AGEs+NAC組：先用含5 mmol/L NAC的DMEM培養(yǎng)基預處理軟骨細胞2 h，再換用含5 mmol/L NAC的AGEs的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h；NAC組：用含5 mmol/L NAC的DMEM培養(yǎng)基處理軟骨細胞24 h。

2.4 DCFH-DA染色測定細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平 將軟骨細胞接種于24孔板，按不同濃度(0、25、50、100、200 mg/L)AGEs、AGEs+NAC和NAC分組，去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，再用10 μmol /L DCFH-DA染液于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下觀察，并隨機選取5個不重復區(qū)攝片。

2.5 Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡 將軟骨細胞接種于24孔板，按上述分組進行處理后，去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，加入Hoechst 33342試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育10 min，后用PBS洗3次，在熒光顯微鏡下觀察細胞,鑒別正常與凋亡的軟骨細胞并攝片，隨機取不同視野計算細胞凋亡率，重復5次。

2.6 流式細胞術檢測軟骨細胞凋亡率 將軟骨細胞接種于6孔板中，按上述分組進行處理后，常規(guī)消化離心收集各組細胞；調整細胞濃度為5×105個細胞，PBS漂洗后將細胞重懸于500 μL 1×binding buffer中; 加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)；輕柔混勻后，室溫避光孵育5 min；應用BD 流式細胞儀上機檢測。

2.7 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2、caspase-3、基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3， MMP3)、MMP13和COL2的mRNA表達量 將軟骨細胞接種于6孔板中，按上述分組進行處理后，使用GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒提取細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明將RNA 逆轉錄成 cDNA。按2×Taq Master Mix說明進行擴增。PCR擴增反應體系為2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，模板cDNA 2 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 90 s; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min,32個循環(huán); 72 ℃ 5 min。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳15 min左右，SIM凝膠成像系統(tǒng)拍照并用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以GAPDH作內參照。

2.8 Western blotting法檢測cleaved caspase-3、MMP3、MMP13及COL2的蛋白水平 將軟骨細胞接種于6孔板中，按上述分組進行處理后，按總蛋白提取試劑盒說明提取細胞蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度。加入4×蛋白質上樣緩沖液95 ℃水浴5 min 變性。每組蛋白上樣量為30 μg，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳；然后用濕轉法將凝膠中的蛋白轉至PVDF 膜上；將PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST 中室溫封閉2 h；分別加入GAPDH(1∶5 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、MMP3(1∶1 000)、MMP13(1∶4 000)和COL2(1∶1 000)的I抗工作液室溫孵育2 h，1×TBST漂洗 5 min 3次；用辣根過氧化物酶標記的II 抗(1∶5 000) 室溫孵育2 h；漂洗后ECL發(fā)光液顯色。試劑盒進行曝光、顯影。以GAPDH為內參照，用ImageJ軟件進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 軟骨細胞的鑒定

分離培養(yǎng)的SD大鼠軟骨細胞貼壁生長，外觀呈三角形或多角形。甲苯胺藍染色使正常軟骨細胞胞漿呈藍色，細胞核呈紫藍色。軟骨細胞經阿爾新藍染色后，可見細胞質染成淡藍色。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色可見細胞質呈黃色，細胞核周圍散在棕黃色的顆粒，見圖1。

Figure 1. The morphological presentation of rat chondrocytes (×100). A: under phase-contrast microscope; B: toluidine blue staining; C: Alcian blue staining; D: immunocytochemical staining for type II collagen.

圖1 軟骨細胞的形態(tài)學表現(xiàn)

2 CCK-8法測定軟骨細胞的存活率

AGEs(0、10、25 mg/L)處理軟骨細胞24 h及48 h后均不影響細胞存活率，但AGEs(50、100、200 mg/L)處理軟骨細胞24 h或48 h后均能顯著降低軟骨細胞存活率(P<0.05)。根據(jù)上述結果，后續(xù)采用100 mg/L AGEs處理軟骨細胞24 h進行研究，見圖2。

Figure 2. Dose- and time-dependent effects of AGEs on the cell viability of rat chondrocytes detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖2 AGEs引起軟骨細胞毒性

3 AGEs引起的軟骨細胞的氧化應激

不同濃度AGEs處理軟骨細胞24 h，可見25、50、100、200 mg/L濃度的AGEs均能使細胞內DCF的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)明顯增強，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。此外，NAC與100 mg/L AGEs 共培養(yǎng)的軟骨細胞與100 mg/L AGEs組相比，MFI明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. AGEs induced accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the chondrocytes (×200). MFI: mean fluorescence intensity．Mean±SD．n=5．*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNAC group;△P<0.05vsAGEs 100 mg/L group.

圖3 AGEs引起軟骨細胞的氧化應激反應

4 AGEs通過氧化應激引起軟骨細胞凋亡

熒光顯微鏡下可見Hoechst染色空白對照組、NAC組中軟骨細胞核染色分布均勻，呈彌散均勻的低密度熒光。AGEs組中細胞核呈致密濃染的凋亡特征的軟骨細胞數(shù)量增多，與control、NAC組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。而AGEs+NAC組中，抗氧化劑NAC與AGEs共培養(yǎng)24 h的軟骨細胞凋亡較AGEs組明顯減少(P<0.05)，見圖4A。

此外，通過Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測結果顯示，AGEs處理軟骨細胞24 h后凋亡率增至(18.90±2.82)%，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。而NAC與AGEs共培養(yǎng)軟骨細胞24 h時，軟骨細胞凋亡率下降至(8.23±1.66)%，與單獨AGEs處理軟骨細胞組相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，見圖4B。

AGEs處理軟骨細胞24 h 可顯著增加Bax/Bcl-2 及caspase-3的mRNA表達量(P<0.05)，而NAC與AGEs共培養(yǎng)軟骨細胞24 h 能抑制AGEs引起的Bax/Bcl-2及caspase-3的mRNA表達量上調(P<0.05)，見圖4C。

Western blotting實驗檢測cleaved caspase-3的蛋白表達量， AGEs可促進凋亡相關蛋白cleaved caspase-3的增加(P<0.05)，而NAC可抑制AGEs引起的cleaved caspase-3的蛋白水平上調(P<0.05)，見圖4D。

5 AGEs通過氧化應激對軟骨細胞基質金屬蛋白酶及Ⅱ型膠原的影響

AGEs作用下，與對照組相比，MMP3及MMP13的mRNA表達顯著增加(P<0.05)，而COL2的mRNA表達顯著下降(P<0.05)。NAC預處理后與AGEs共培養(yǎng)軟骨細胞，能顯著抑制MMP3和MMP13的mRNA表達量并提高COL2的mRNA表達量(P<0.05)，見圖5A。Western blotting實驗結果可見，AGEs可促進軟骨細胞表達MMP3及MMP13，并降低COL2的蛋白水平(P<0.05)，而NAC可抑制MMP3、MMP13的蛋白水平并提高COL2的蛋白水平(P<0.05)，見圖5B。

Figure 4.NAC reduced AGEs-induced apoptosis of chondrocytes. A: the changes of apoptotic cells detected by Hoechst 33342 nuclear staining (×400); B: flow cytometry analysis of the apoptosis in chondrocytes; C: the mRNA levels of Bax, Bcl-2 and caspase-3 measured by RT-PCR; D: the protein level of cleaved caspase-3 measured by Western blotting. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNAC group;△P<0.05vsAGEs group.

圖4 AGEs通過氧化應激引起軟骨細胞凋亡

Figure 5.The effects of NAC on the expression of MMP3, MMP13 and COL2 in the chondrocytes induced by AGEs. A: the mRNA levels of MMP3, MMP13 and COL2 measured by RT-PCR; B: the protein levels of MMP3, MMP13 and COL2 measured by Western blotting. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNAC group;△P<0.05vsAGEs group.

圖5 AGEs通過氧化應激上調軟骨細胞中MMP3和MMP13表達，下調COL-2表達

討 論

AGEs是還原糖(葡萄糖)與蛋白、脂質經過一系列非酶糖基化反應(即Maillard 反應)形成的不可逆性終末期產物[5]，常沉積于關節(jié)軟骨、皮膚膠原組織及心包液中[9]。正常情況下，體內AGEs的水平維持在一個較為平衡的狀態(tài)，糖尿病、衰老或飲食攝入高溫處理的食物都將引起體內AGEs水平明顯升高，后產生一系列病理生理改變。軟骨細胞外基質主要由Ⅱ型膠原及蛋白聚糖組成，其生物半衰期較長，更易發(fā)生非酶糖基化。AGEs形成使得膠原分子間相互交聯(lián)增多，導致膠原彈性下降，引起軟骨結構及功能的改變[10]。研究表明，關節(jié)軟骨退變病人的正常軟骨中AGEs含量明顯升高[11]。動物實驗研究同樣發(fā)現(xiàn)，15個月小鼠膝關節(jié)軟骨中的AGEs含量明顯高于2個月的小鼠[12]。

軟骨細胞在維持軟骨形態(tài)和功能方面發(fā)揮重要作用，軟骨基質的合成與更新主要依靠軟骨細胞[13]。軟骨細胞凋亡引起的細胞數(shù)量進行性減少，使細胞外基質合成減少、破壞增加是導致OA的重要原因。因此，軟骨細胞凋亡數(shù)量與OA的程度密切相關。衰老引起的線粒體功能損害導致軟骨細胞凋亡在OA發(fā)病中起關鍵作用[14]。 而線粒體功能障礙與氧化應激密切相關。氧化應激可誘導細胞內ROS及活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)大量產生[15]。線粒體功能損害時，線粒體Ca2+內流增加一方面可促進ROS的形成，另一方面可降低線粒體膜電位引起 ATP合成的功能障礙，這樣又導致Ca2+內流及ROS的進一步增加。線粒體途徑引起的細胞凋亡可引起線粒體膜上多種凋亡相關蛋白因子表達。Bcl-2 是抗細胞凋亡因子，Bax 是促細胞凋亡因子，Bax/Bcl-2這對作用相反的細胞凋亡因子共同激活其下游的一系列凋亡因子，引發(fā)細胞凋亡[16]。此外，caspase-3是引起細胞凋亡過程的核心效應器，無活性前體的procaspase-3被激活生成活性片段cleaved caspase-3被看作是細胞發(fā)生凋亡的標志之一[17]。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)AGEs可通過氧化應激導致軟骨細胞凋亡，這與Yang等[7]研究結果一致。

正常軟骨基質合成及降解處于動態(tài)平衡，當軟骨受損后，基質金屬蛋白酶的增多對Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等細胞外基質的降解作用，打破了這種平衡，細胞外基質大量降解可引起關節(jié)軟骨完整性的破壞。研究顯示，髖關節(jié)退變患者血清MMP3的濃度比正常人升高[18]。此外， MMP13被認為是骨性關節(jié)炎發(fā)展中最重要的膠原蛋白酶。因為，MMP13對Ⅱ型膠原蛋白的水解能力是其他MMPs的5～10倍，并且在OA發(fā)病時，MMP13可表達于更深層的軟骨中[19]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能損害時可通過ROS上調引起MMPs增加[20]，尤其可導致軟骨細胞MMP3和MMP13的表達上調[21]。 此前，已有學者對AGEs引起軟骨細胞MMPs表達上調作出研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可顯著提高軟骨細胞中MMP-1、-3、-13的表達量[22]。本次研究通過RT-PCR及Western blotting技術檢測發(fā)現(xiàn)AGEs可引起MMP3和MMP13表達上調，繼而影響Ⅱ型膠原的表達下降。而將抗氧化劑NAC作用于AGEs誘導的軟骨細胞時可逆轉上述現(xiàn)象，證明AGEs誘導軟骨細胞MMP3和MMP13上調與氧化應激有關。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Advanced glycation end products induce rat chondrocyte injury by modulating oxidative stress

HUANG Wen-zhou1, WANG Li-li2, YIN Chang-chang2, LI Jian1, AO Peng1, CHENG Xi-gao1

(1DepartmentofOrthopedics,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2JiujiangUniversity,KeyLaboratoryofMedicalTransformationofJiujiang,Jiujiang332000,China.E-mail: 228206846@qq.com)

AIM: To explore the possibility that advanced glycation end products (AGEs) induces rat chondrocyte injury by modulating oxidative stress. METHODS: Primarily cultured rat chondrocytes were identified. The viability of the chondrocytes was measured by CCK-8 assay. The intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) were detected by DCFH-DA staining. The number of apoptotic cells was determined by Hoechst 33342 nuclear staining and flow cytometry. RT-PCR was performed to measure the mRNA levels of Bax, Bcl-2, caspase-3, MMP3, MMP13 and COL2 in the chondrocytes. Western blotting was used to evaluate the protein levels of cleaved caspase-3, MMP3, MMP13 and COL2. RESULTS: Compared with control group, the intracellular levels of ROS in the chondrocytes treated with AGEs were significantly increased (P<0.05), and pretreatment withN-acetyl-L-cysteine (NAC) suppressed the formation of ROS (P<0.05). Besides, NAC inhibited AGEs-induced apoptosis of the chondrocytes, as indicated by reduceing the levels of Bax/Bcl-2 and caspase-3, decreased the expression of MMP3 and MMP13, and reduced the loss of COL2. CONCLUSION: AGEs induce chondrocyte injury by activating oxidative stress.

Advanced glycation end products; Osteoarthritis; Oxidative stress; Matrix metalloproteinases; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 2036- 07

2016- 05- 26

2016- 09- 13

國家自然科學基金資助項目(No. 81060147)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.020

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