PCR技術(shù)在梅毒檢測中的應(yīng)用

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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421001)

·文獻(xiàn)綜述·

PCR技術(shù)在梅毒檢測中的應(yīng)用

朱雅玲，劉雙全*

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421001)

梅毒是一種由梅毒螺旋體(TP)感染引起的慢性性傳播疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。目前常用實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有暗視野顯微鏡法和血清學(xué)方法。近年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷中得以應(yīng)用，在早期梅毒以及特殊梅毒的診斷中顯示出靈敏度高、特異性較強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。本文就PCR檢測技術(shù)在梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷中的研究進(jìn)展予以綜述。

梅毒； 梅毒螺旋體； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 實(shí)驗(yàn)室診斷

梅毒是一種由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，TP)感染所引起的慢性、全身性的性傳播疾病。梅毒早期表現(xiàn)為皮膚黏膜潰瘍和皮疹，晚期表現(xiàn)為一系列包括心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。梅毒在一期和二期的傳染性最強(qiáng)，因此早期診斷能有效防止梅毒傳播[1]。由于TP尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，目前梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷，主要用直接病原體檢查和梅毒血清學(xué)方法[2]。直接病原體檢查如暗視野顯微鏡(Dark field microscope，DFM)的結(jié)果很大程度受實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員專業(yè)經(jīng)驗(yàn)的影響；而一期梅毒、胎傳梅毒以及神經(jīng)梅毒通過常規(guī)血清學(xué)方法檢測的特異性和靈敏性偏低，常出現(xiàn)假陰性，因而需要對患者反復(fù)進(jìn)行檢測，這可能導(dǎo)致治療的延誤，增加發(fā)生并發(fā)癥的可能性以及潛在的傳染性。近年來，隨著TP全基因組的解析，PCR技術(shù)在梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷過程中得到應(yīng)用，尤其一期梅毒、先天性梅毒和神經(jīng)梅毒的診斷中體現(xiàn)出較好的應(yīng)用價(jià)值[2]，特別是在低病原體水平以致不足以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgM和(或)IgG的情況下[3]?，F(xiàn)就PCR檢測技術(shù)在梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷中的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 PCR檢測技術(shù)類型

美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)最近重新確定了一期和二期梅毒的定義，并指出在繼基準(zhǔn)測試DFM方法之后，PCR被認(rèn)為是診斷梅毒常用的高度特異、敏感的分子生物學(xué)方法，可用于檢測早期梅毒各臨床樣品中微量TP及對不同TP臨床株進(jìn)行基因分型[4]。目前實(shí)驗(yàn)室診斷梅毒常見的PCR技術(shù)主要有巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)和逆轉(zhuǎn)錄-PCR(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)等。檢測標(biāo)本包括血(血清、全血)、羊水、腦脊液、皮損材料(分泌物、組織)等。檢測的目標(biāo)基因包括TP47、TmPA、TmPB、4D等表面脂蛋白以及polA等參與基因組復(fù)制酶的編碼基因[5]。見表1。

1.1常規(guī)PCR 常規(guī)PCR法與TPPA、暗視野鏡檢等方法相比，雖然其特異性和敏感性有所提高，但在檢測TP含量低且含有難去除的Taq酶抑制因子的血、腦脊液等標(biāo)本時(shí)，其敏感性仍較低[6]，且由于其操作繁瑣，近年已很少用于臨床梅毒檢測。

1.2巢式PCR 巢式PCR是一種應(yīng)用兩對特異性引物的PCR技術(shù)。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和常規(guī)PCR相似，第二對引物以第一次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，因此巢式PCR較于常規(guī)PCR敏感性得到極大提升，推薦用于診斷臨床表現(xiàn)不明顯或者血清學(xué)診斷為陰性的可疑梅毒、暗視野顯微鏡檢查為陰性的一期梅毒，以及包括伴有艾滋病的梅毒、神經(jīng)梅毒等特殊梅毒。此外，巢式PCR對判斷梅毒患者血液的傳染性、判定疾病治療效果、研究梅毒的發(fā)病機(jī)制以及完善流行病學(xué)也具有重要的意義，還能用于篩選假陰性樣本。

雷震山等[7]根據(jù)TP47基因設(shè)計(jì)巢式PCR引物，檢測一期梅毒患者195例硬下疳分泌物以及血液標(biāo)本，同時(shí)與TRUST和TP-ELISA血清學(xué)方法以及暗視野鏡檢對比，發(fā)現(xiàn)相較于顯微鏡檢查和TP-ELISA，巢式PCR的靈敏度和特異性均更高，表明在早期梅毒診斷中，巢式PCR與血清學(xué)檢測以及暗視野鏡檢相結(jié)合，可以有效減少漏檢，更有利于梅毒的早診斷早治療。

表1TPPCRDNA擴(kuò)增引物

DNA靶引物對引物名序列5'～3'產(chǎn)物長度TP471TP471TCATCATGAGACGCACTATC308bpTP472CACGCACCATCTTAGTAACG2TP473GACAATGCTCACTGAGGATAGT658bpTP474ACGCACAGAACCGAATTCCTTG3TP475AGTAACGCTTGGGTCAGTCTCG122bpTP476CGTTCCGTCAGCAATTTCAGTA4TP477AGGGGAAGGTGCTGACCATAG146bpTP478GGGAGTGAAATCCGCAGAGAGTP479(探針)(6-FAM)AGCCTAAGCTTGTCAGCGATCAAGC(BHQ1)5TP4710CGAGGAATACAAGATTACGAACG178bpTP4711ACGTGCAGAAAAACTATCCTCAGpolA6polA1GGTGAACTCCGGTATTGAA200bppolA2CATCCGTTTCACAATCAAApolA3(探針)FAM-AG-TAACACCACGATAATGACCTGC-MGBTmPA7PHT1GCAGTGTCTGCAATCCACCGT599bpPHT2CGAGAAATTACGTGTCGTCAT4D8PHD1TGTACCGGACGCTCGTGCCATT428bpPHD2TTGGCCTTTCCCAACGTCCTCAG

1.3半巢式PCR 巢式PCR與普通PCR相比雖有很大進(jìn)步，但仍有操作較繁瑣、成本相對較高等缺點(diǎn)，因此又發(fā)展出半巢式PCR。半巢式PCR是在第二次擴(kuò)增時(shí)只增加一條引物進(jìn)行擴(kuò)增，在巢式PCR優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上有操作簡化、成本較低等特點(diǎn)。

周瀟等[8]以TP polA基因，取已診斷為一期梅毒的60例患者的潰瘍面組織液做半巢式PCR，同時(shí)取全部患者的血液標(biāo)本做半巢式PCR和TPPA，顯示半巢式PCR檢測一期梅毒有很好的特異性；從敏感性來看，檢測早期梅毒組織液標(biāo)本半巢式PCR比TPPA敏感性高，檢測早期梅毒血液標(biāo)本時(shí)則是TPPA更高；而半巢式PCR檢測早期梅毒組織液標(biāo)本比血液標(biāo)本敏感性高，以上提示：一期梅毒的半巢式PCR在以組織液為標(biāo)本時(shí)具有高特異性和敏感性，而以血液為標(biāo)本時(shí)敏感性較低，因此，取組織液進(jìn)行半巢式PCR檢測TP更有應(yīng)用價(jià)值，而用血液進(jìn)行檢測則推薦進(jìn)行TPPA檢測。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTFQ-PCR) RTFQ-PCR是將熒光標(biāo)記探針加入到普通PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號的出現(xiàn)及其積累強(qiáng)度對PCR全進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，利用得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析，較之普通PCR方法，RTFQ-PCR技術(shù)具有穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，是目前梅毒診斷的主要分子生物學(xué)方法。

Tipple C等[9]建立基于TP47基因的FQ-PCR，對99例梅毒患者的潰瘍和血液標(biāo)本(包括一、二期梅毒、早期潛伏梅毒、神經(jīng)梅毒以及陰性血清)進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-PCR在一期梅毒取潰瘍標(biāo)本和全血標(biāo)本相比較，兩者特異性都很高，但靈敏度上潰瘍標(biāo)本明顯高于全血標(biāo)本，而在二期梅毒中兩種標(biāo)本的靈敏度和特異性無顯著差異；FQ-PCR可以對臨床標(biāo)本中的TP進(jìn)行定量測試，并提供梅毒感染的動(dòng)力學(xué)結(jié)果；在梅毒不同階段的潰瘍和血液中所發(fā)現(xiàn)的TP數(shù)量是遵循生物學(xué)合理模式；FQ-PCR方法檢測潰瘍中若存在大量TP則可能表示HIV-1陽性患者更容易傳播梅毒。

王瑩等[10]構(gòu)建了基于TP47基因的FQ-PCR方法，并對其檢測TP的特異性、靈敏度進(jìn)行了評測。以PMD18-T-TP47質(zhì)粒做為陽性對照，通過對大腸桿菌等基因組DNA進(jìn)行提取及FQ-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；同時(shí)對梅毒螺旋體TP47基因同源性進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)TP47基因序列以99%的相似度僅保守存在于不同梅毒螺旋體菌株中，提示基于TP47基因的FQ-PCR法有很高特異性。通過以不同濃度的重組質(zhì)粒PMD18-T-TP47為模板進(jìn)行QF-PCR檢測來評價(jià)該方法的敏感性，結(jié)果顯示以10個(gè)/mL的質(zhì)粒濃度為模板時(shí)檢測結(jié)果為陽性，提示該方法具有較高靈敏度。通過對20份臨床分離TP進(jìn)行FQ-PCR檢測，其結(jié)果均為陽性，與血清學(xué)檢測結(jié)果一致，提示該方法適用于臨床標(biāo)本檢測。

趙丹等[11]建立基于TP特異性外膜蛋白Gpd基因的TP重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和其二聚體蝎型探針定量PCR，該新型FQ-PCR檢測22例確診病例均為陽性，檢測8例健康體檢者均為陰性，其靈敏性、特異性、陽性預(yù)測值皆為100%；與以Taqman為探針的FQ-PCR同時(shí)檢測40例疑似梅毒患者血清標(biāo)本，新型FQ-PCR的陽性檢出率為82.5%，明顯高于以Taqman為探針的FQ-PCR。以上可知，二聚體蝎型探針定量PCR具有很高靈敏性和特異性，其更有利于臨床梅毒的早期診斷。

郭文秀[12]等基于polA基因序列建立FQ-PCR法，檢測不同國家和人種TPPA抗體陽性和陰性患者的血液，對新建的FQ-PCR的特異性和靈敏度以及這兩種方法結(jié)果的符合率做相關(guān)評析，其試驗(yàn)結(jié)果顯示該新建FQ-PCR有很高的特異性和靈敏度，可用于排除非現(xiàn)行感染梅毒但TPPA法陽性的患者，提高了對不同國家、種族的旅行者的梅毒診斷的正確性。

Cornut PL等[13]研究FQ-PCR對診斷房水中的TP的臨床價(jià)值，對確診有眼部梅毒的患者的房水進(jìn)行FQ-PCR檢測polA基因，認(rèn)為該方法檢測房水能確認(rèn)梅毒性葡萄膜炎。

楊梅[14]比較FQ-PCR法和免疫印跡法對新生兒梅毒的診斷，結(jié)果顯示FQ-PCR敏感性和特異性分別為98%和100%，明顯高于免疫印跡法的84%和85%，認(rèn)為在診斷新生兒先天梅毒中，F(xiàn)Q-PCR優(yōu)于免疫印跡法，值得在臨床中推廣。

Kai-Hua Chi[15]等開發(fā)了基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光多重PCR法，以TP0858為目的基因，它能在單個(gè)檢測中同時(shí)且快速地對蒼白密螺旋體的蒼白亞種(梅毒病原體)、地方亞種(地方性梅毒病原體)和極細(xì)亞種(雅司病原體)進(jìn)行區(qū)分，可用于對個(gè)例的篩查和研究，尤其對雅司病的診斷有很高的特異性和靈敏度。

以上研究表明，F(xiàn)Q-PCR法對于一期梅毒及新生兒天生梅毒的檢測具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、快速高效的優(yōu)點(diǎn)。對于無臨床癥狀的潛伏梅毒，由于不能通過顯微鏡法得出診斷，而其所依賴的血清學(xué)方法也因感染時(shí)間增長而敏感性降低常不能有效作出診斷[16]，應(yīng)用FQ-PCR法對潰瘍標(biāo)本進(jìn)行檢測則能有效檢出TP，并且能對TP進(jìn)行定量分析，有利于臨床對潛伏梅毒等特殊梅毒的診斷與分析。FQ-PCR更能用于檢測TP分子分化亞種，其結(jié)合經(jīng)典血清學(xué)方法對確定全球TP亞型地理分布以及對特有TP的根除有重要的作用[15]。

1.5圓盤式超快速熒光定量PCR 張慧嫦等[17]為減短診斷梅毒時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)間，提高其反應(yīng)效率，以FQ-PCR為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)發(fā)明了新型圓盤式超高速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，以TP17特異基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物探針，建立了圓盤式超快速熒光定量PCR方法來檢測TP，以新建熒光定量PCR法和普通熒光定量PCR法對36份TRUST、TPPA均陽性的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測對比。顯示圓盤式超快速熒光定量PCR方法特異性100%，其精密度較高，陽性和陰性質(zhì)控品在不同時(shí)間測試3次以及同時(shí)間5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果CV均<5%，因此可認(rèn)為該方法在梅毒快速診斷上有一定的應(yīng)用前景，其對判斷血液中TP增殖能力具有很大的潛在價(jià)值。

1.6多重PCR 多重PCR是在同一個(gè)反應(yīng)管中用多對引物同時(shí)擴(kuò)增幾條DNA片段，常用于與其他病原體同時(shí)檢測。Palmer[18]等通過對98例有潰瘍的梅毒患者進(jìn)行血清學(xué)檢測和以TP47為目的基因的多重PCR檢測作對比分析，多重PCR檢測原發(fā)性梅毒的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為94.7%、94.7%、98.6%和98.6%，對二次梅毒的診斷則分別為80%、98.6%、88.9%和97.2%，顯示多重PCR法是一種敏感、特異的梅毒檢驗(yàn)方法，可作為顯微鏡法級TPPA法的重要輔助診斷方法。但由于多重PCR法同時(shí)擴(kuò)增的DNA片段越多，操作則越繁瑣，在很多現(xiàn)實(shí)條件的限制下，近年來多重PCR已很少應(yīng)用在梅毒臨床檢測中。

1.7逆轉(zhuǎn)錄-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA；再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。用于逆轉(zhuǎn)錄PCR設(shè)計(jì)引物的靶基因是16srRNA，它需要Southern印跡雜交試驗(yàn)來保證其特異性，因此，操作比較繁瑣，近年來臨床上已很少使用。

2 結(jié) 語

綜上所述，PCR方法在梅毒早期診斷以及特殊梅毒診斷中，具有高特異性、高靈敏度和穩(wěn)定且快速的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的臨床應(yīng)用前景。隨著全球梅毒發(fā)病率的不斷提高[19-21]，梅毒對公共衛(wèi)生的影響已經(jīng)越來越嚴(yán)重。如能將PCR法與血清學(xué)方法、暗視野顯微鏡法相結(jié)合，相信會(huì)更有利于早期梅毒以及特殊梅毒的診斷以及治療。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.06.024

2016-01-01；

2016-06-15

國家自然科學(xué)基金(81201331).

*通訊作者，E-mail:littletwod@outlook.com.

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蔣湘蓮)