耐輻射短梗霉黑色素的發(fā)酵條件優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

朱 靜，房世杰，王 瑋，唐琦勇，張志東，張麗娟，顧美英，宋素琴

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，烏魯木齊 830016）

耐輻射短梗霉黑色素的發(fā)酵條件優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

朱 靜1，房世杰2，王 瑋1，唐琦勇1，張志東1，張麗娟1，顧美英1，宋素琴1

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，烏魯木齊 830016）

【目的】利用響應(yīng)面法對出芽短梗霉菌株MF1發(fā)酵水溶性黑色素工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，開展穩(wěn)定性研究?！痉椒ā坷?Design－expert 7.5設(shè)計軟件，以黑色素產(chǎn)量為指標(biāo)，采用 Plackett－Burman法篩選出三個重要因素，使用 Box－Benhnken中心組合設(shè)計并進(jìn)行條件優(yōu)化。【結(jié)果】響應(yīng)面優(yōu)化及各因素交互作用分析確定最佳發(fā)酵條件為：裝添量為100mL，葡萄糖為10.3g／L，酵母浸粉為2.02g／L時，黑色素最高產(chǎn)量達(dá)到0.53g／L。所得黑色素具有良好的水溶性，較高的酸堿、熱穩(wěn)定性，不易被氧化還原，金屬離子對色素穩(wěn)定性影響不顯著?！窘Y(jié)論】葡萄糖、酵母浸粉和裝填量為影響黑色素產(chǎn)量的三個主要因素，為天然水溶性黑色素的中試放大、大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

黑色素；出芽短梗霉；響應(yīng)面；發(fā)酵

0 引 言

【研究意義】天然黑色素（melanin）是一種廣泛存在于動植物和微生物中的非均質(zhì)類多酚聚合體，是一類高分子量褐色 －黑色素的總稱［1］。黑色素在紫外線和可見光波長（150～800 nm）均具有良好的光吸收作用，特別是在紫外光下具有極強的吸收能力［2］。其一般可溶于堿性溶液，不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常見有機(jī)溶劑；具有較強的清除自由基、抗氧化等功能，優(yōu)于SOD、VE等常規(guī)抗氧化產(chǎn)品［3，4］；部分黑色素具有電導(dǎo)性等功能，部分可溶性黑色素在體外對艾滋病病毒有顯著的抑制作用，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、材料和化學(xué)及醫(yī)藥等領(lǐng)域［5－9］。因此，黑色素應(yīng)用潛力巨大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微生物來源的黑色素種類多樣，自然界中多種微生物可產(chǎn)黑色素，包括細(xì)菌、放線菌和霉菌等［10］。但黑色素不是微生物生長、代謝所必須的代謝產(chǎn)物，所以產(chǎn)量一般都不 高［11］。出芽 短 梗 霉 （Aureobasidium pullulans）是一種具有酵母型和菌絲型形態(tài)的多形真菌，因生長后期易產(chǎn)生黑色素而一度被認(rèn)為是“黑酵母”。該菌是工業(yè)生產(chǎn)中重要生物材料短梗霉多糖（普魯蘭多糖，Pullulan）的生產(chǎn)菌株［12］，其厚垣孢子積累黑色素［13］，可抵抗紫外線、高滲脅迫及重金屬毒害等多種逆境［14－16］。目前對其相關(guān)菌株的耐輻射特性和機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，黑色素的產(chǎn)生對真菌的耐輻射作用至關(guān)重要，部分真菌黑色素甚至可以俘獲離子輻射能量作為能源［17］?！颈狙芯壳腥朦c】從新疆輻射污染土樣中分離篩選出多株短梗霉菌株［13］。其中，菌株 MF1在發(fā)酵中大量產(chǎn)生水溶性黑色素。研究相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】在前期單因素發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)上［18］，利用響應(yīng)面法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，并對其黑色素的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為天然黑色素在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種

實驗菌株MF1由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所提供，分離自輻射污染環(huán)境土壤，經(jīng)系統(tǒng)鑒定為出芽短梗霉變種（Aureobasidium pullulans var sp.），該菌株可以在60Coγ射線 20 kGry劑量照射下存活［13］。

1.1.2 培養(yǎng)基

MEA培養(yǎng)基：麥芽浸粉 30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂15 g，加蒸餾水配制 1 L，pH 5.6。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，K2HP045.0 g，酵母浸粉2.0 g，MgS040.4 g，（NH4）2SO40.6 g，NaCl 0.1 g，蒸餾水1 L，pH 6.5。

1.2 方 法

1.2.1 菌株接種

將保存的出芽短梗霉菌株接種于 MEA培養(yǎng)基斜面上，于30℃培養(yǎng)2～4 d。取新鮮斜面菌種1環(huán)，接種于100mL液體MEA培養(yǎng)基中，30℃，180 r／min，培養(yǎng) 48 h。取 lmL菌液接種于100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r／min，培養(yǎng) 5～7 d。

1.2.2 黑色素的測定及提取

從新鮮斜面挑取一環(huán)菌苔，接種于100mL液體MEA培養(yǎng)基中，30℃，180 r／min搖床培養(yǎng)48 h，取1mL菌液接種于 100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃180 r／min搖床培養(yǎng)96 h后，離心去菌體，上清液采用紫外分光光度計于400 nm下測定其光吸收值。

將發(fā)酵液離心取上清，2倍無水乙醇沉淀，9 000 r／min離心5 min后，棄上清液，沉淀于80℃烘干24 h后，所得產(chǎn)物為黑色素粗提物。再經(jīng)DMSO溶解，5 000 r／min離心10 min，用酸性甲醇（pH＝2）做沉淀劑重復(fù)2次，最后的沉淀用丙酮洗滌3次，烘干備用。

1.2.3 二水平設(shè)計

使用 Design－expert 7.5設(shè)計軟件，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要成分及裝填量、接種量等6個實際因素，5個虛擬因素進(jìn)行試驗分析，采用試驗次數(shù) N＝12的Plackett－Burman設(shè)計，對11因素進(jìn)行考察，響應(yīng)值 Y為黑色素濃度（OD值，已稀釋800倍）。其中，6個實際因素兩水平分別取原水平的 ±0.25倍，測定各因素對黑色素產(chǎn)量的影響顯著性。表1

表1 Placket－Burman設(shè)計及因素水平Table 1 Plackett－Burman design and factor level

1.2.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)二水平設(shè)計結(jié)果，選出影響最大的三個因素作為考察因素，采用Box－Behnken中心組合實驗設(shè)計，各取3水平，采用3因素3水平的共計14個實驗點，其中12個分析點，2個為對照，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析方法對發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.2.5 黑色素穩(wěn)定性

稱取一定量的黑色素提取物，使用去離子水配置成不同濃度的黑色素溶液。分別取5mL上述黑色素溶液，各加入不同體積的氧化劑、還原劑、金屬離子等溶液，加入去離子水定容至50mL，置于不同條件下處理，于 λ＝400處測定其OD值，根據(jù)殘余率（%）＝處理樣 OD／對照樣OD×100%，計算色素殘余率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑色素紫外 －可見光吸收光譜測定

研究表明，水溶性黑色素在紫外 －可見光譜200～800 nm均有不同程度的吸收，其中在紫外光譜下吸收更大，225 nm具有一最大吸收峰，隨之迅速下降，這一特性與目前已有報道黑色素有著明顯的差別。一般而言，黑色素由于高度的共軛效應(yīng)而產(chǎn)生廣譜的光吸收特性。但不同的菌種所產(chǎn)黑色素有所不同，如寧華等［1］從酪氨酸基因工程菌提取的黑色素紫外掃描顯示無特征峰，段曉紅等［19］從嗜麥芽假單胞菌 ATl8獲得的黑色素紫外掃描顯示在210 nm有一特征吸收峰。目前，一般選擇 400 nm波長來測定黑色素的吸收值。圖1

2.2 Placket－Burman優(yōu)化

選用試驗次數(shù) N＝12的試驗設(shè)計，對6個實際因素和3個虛擬因素（A－I）進(jìn)行考察，得到響應(yīng)值 Y為黑色素濃度。通過二次項計算，得出各因素效應(yīng)結(jié)果。表2，表3

葡萄糖、酵母浸粉、裝填量對菌株產(chǎn)生黑色素的影響較大，影響率分別為 29.05%、28.78%、10.07%。其中葡萄糖，酵母浸粉，裝填量對產(chǎn)生黑色素的影響均為正相關(guān)，即隨著葡萄糖、酵母浸粉、裝填量的增加，黑色素的產(chǎn)生量也隨之增加，而虛擬因素對系統(tǒng)影響率均小于 10%，結(jié)果可信。因此，可選擇葡萄糖、酵母浸粉、裝填量三個因素為主要因素進(jìn)行下一步實驗。表3

圖1 黑色素的紫外—可見光吸收圖譜Fig．1 Melanin UV－visible absorption spectrum

表2 Placket－Burman設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Plackett－Burman design table and test results

表3 各因素效的影響效應(yīng)Table 3 Efficiency factors of each factor

2.3 響應(yīng)面表設(shè)計及模型

2.3.1 Box－Behnken實驗結(jié)果

依據(jù)Placket－Burman分析結(jié)果，采用 Box－Behnken實驗設(shè)計，結(jié)果表明，回歸模型方差分析。由表 4中，F(xiàn)回歸＝7.15＞ F0.0500，可知設(shè)計中不同處理間差異不顯著；失擬項 P＝0.016 5＜0.05，差異顯著，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起；R2為0.936 0，表明方程可較好的預(yù)測結(jié)果；其二次方程為：表4，表5

R＝167.50＋15.62×A＋8.87×B＋14.75× C－2.25×A×B＋14.50×A×C－9.00×B×C－22.62×A2－27.62×B2＋3.62×C2.

表4 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table 4 Response surface design and results

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression model analysis of variance

2.3.2 響應(yīng)面及等高線圖解析

對表1的結(jié)果作響應(yīng)面及其等高線，結(jié)果表明，各圖表示A（葡萄糖）、B（酵母浸粉）、C（接種量）中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對其發(fā)酵優(yōu)化的交互影響。研究表明，各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，圖中等高線均存在極值，即響應(yīng)面的最高點，說明試驗所選范圍較合理。三個響應(yīng)面的等高線總體為圓形或橢圓形，說明交互作用不是很強，但是不同因素間交互仍然有著明顯的差異。葡萄糖量和裝填量對黑色素產(chǎn)量的影響更大（圖2（a）、（c）），而酵母浸粉相對較為平緩，葡萄糖與裝填量兩者有一定的交互作用，但等高線幾乎為圓形，說明作用不是很強（圖2（b））。圖2

圖2 葡萄糖、酵母浸粉、裝填量與黑色素產(chǎn)量的交互作用Fig．2 Interaction of glucose，yeast extract，the filling amount and melanin production

2.4 發(fā)酵工藝條件的確定

結(jié)合回歸模型分析結(jié)果可知，天然水溶性黑色素的最佳發(fā)酵工藝條件為：裝添量為 100mL，葡萄糖10.3g／L，酵母浸粉2.02g／L，硫酸銨2.0g／L，NaCl 0.5g／L，接種量為 2mL，pH自然，30℃，180 r／min搖床培養(yǎng)96 h。通過實驗驗證，在此條件下黑色素的理論提取率為 0.57g／L，實際產(chǎn)量最高為0.53g／L。因此，響應(yīng)面分析法所優(yōu)化的最適宜發(fā)酵工藝條件真實可靠。

2.5 黑色素的穩(wěn)定性

2.5.1 黑色素?zé)岱€(wěn)定性

分別將色素溶液置于不同溫度溫箱中加熱 2 h，冷卻至室溫，在波長 400 nm處測定其吸光度，計算殘余率。研究表示，該黑色素具有極其高的熱穩(wěn)定性。圖3

圖3 不同溫度下黑色素穩(wěn)定性變化Fig．3 Effect of temperature on the stability of melanin

2.5.2 黑色素pH穩(wěn)定性

使用 HCl和 NaOH分別調(diào)成不同pH的黑色素溶液，室溫過夜放置，于波長 400 nm處測定吸光度，計算殘余率。研究表明，黑色素具有較高的pH穩(wěn)定性，在酸性情況下黑色素有所下降，可能由于多糖消解，部分黑色素游離后在酸性情況下沉淀。而堿性條件也可能多糖水解，但黑色素可良好的溶于堿性條件下，所以影響不大。圖4

圖4 不同pH下黑色素穩(wěn)定性變化Fig．4 Effect of pH on the stability of melanin

2.5.3 氧化劑對黑色素穩(wěn)定性的影響

使用NaClO和 H2O2分別調(diào)成不同濃度氧化劑的黑色素溶液，室溫放置不同時間后，于波長400 nm處測定其吸光度，計算殘余率。研究表明，該色素在氧化劑中具有較好的穩(wěn)定性。這也與其他菌種黑色素的結(jié)論相一致：真菌黑色素可抵抗高錳酸鉀鹽、次氯酸鹽及其他氧化物的氧化作用；說明不同菌種所產(chǎn)黑色素都具有抗氧化劑的功能。表6，表7

2.5.4 還原劑對黑色素穩(wěn)定性的影響

使用Na2S2O3配制不同濃度的黑色素溶液，室溫放置不同時間后，于波長400 nm處測定其吸光值，計算殘余率。研究表明，黑色素對硫代硫酸鈉具有一定的抗還原功能，但高濃度的還原劑對黑色素影響較大。表8

2.5.5 金屬離子對黑色素的影響

分別使用0.05 M金屬離子配制黑色素溶液，室溫放置一周后，于波長400 nm處測定其吸光度，計算殘余率。研究表明，該黑色素在0.05 M金屬離子環(huán)境下總體具有較好的穩(wěn)定性，但不同離子的影響不 同，K＋、Na＋無影響，Al3＋、Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋具有增效作用，而 Cu2＋、Ca2＋具有降效的作用。同時在實驗過程中，隨著離子濃度增高，黑色素穩(wěn)定性明顯降低。圖5

表6 不同濃度 NaClO下黑色素穩(wěn)定性變化Table 6 Effect of NaClO on the stability of melanin

表7 不同濃度H2O2下黑色素穩(wěn)定性變化Table 7 Effect of H2O2on the stability of melanin

表8 不同濃度Na2S2O3下黑色素穩(wěn)定性變化Table 8 Effect of Na2S2O3on the stability of melanin

圖5 不同金屬離子下黑色素穩(wěn)定性變化Fig．5 Effects of different metal ions on the stability of melanin

3 討 論

微生物產(chǎn)生的黑色素可分為胞內(nèi)黑色素和胞外黑色素兩大類。黑色素一般不溶于水、酸及大部分有機(jī)試劑，但在某些情況下，黑色素與蛋白質(zhì)或者糖類結(jié)合，會導(dǎo)致黑色素具有一定的水溶性［20］。研究選用的出芽短梗霉分離自輻射區(qū)污染土壤，通過對菌株的研究發(fā)現(xiàn)，該菌易于培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中黑色素與短梗霉多糖同時產(chǎn)生并結(jié)合。該菌除產(chǎn)生大量胞內(nèi)黑色素外還產(chǎn)生大量可溶性的黑色素，推測可能是因為與多糖緊密結(jié)合使其具有了良好的水溶性。已有研究表明，微生物合成黑色素的能力可能與其提高自身環(huán)境生存能力有關(guān)，這是因為黑化的細(xì)胞壁更加完整，可以增強其抵抗冷、熱、干旱等惡劣環(huán)境的能力。此外，黑色素還可以結(jié)合自然界中一些對細(xì)胞存在潛在傷害的重金屬元素，使微生物在較嚴(yán)重的污染環(huán)境下仍能較好生存。此外，黑色素還可以起到生理性氧化還原緩沖液的作用，因此，在黑化的微生物中許多都具有抵抗氧化傷害的能力［21］。實驗選用的菌株為耐輻射菌，具有較強的耐 γ射線輻射和耐 UV能力［13］，這可能與其大量產(chǎn)生黑色素有關(guān)。

利用Design－expert軟件的Planket－Burman設(shè)計法對黑色素產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件進(jìn)行篩選優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、酵母浸粉和裝填量是三個最主要的影響因素。研究中的黑色素的產(chǎn)生與細(xì)胞生長是半偶聯(lián)發(fā)酵，其中葡萄糖和酵母浸粉不僅為細(xì)胞生長提供碳、氮源及微量元素，以利于細(xì)胞的生長，同時為黑色素的合成提供能源、碳骨架和氮元素。有相關(guān)報道指出，短梗霉黑色素發(fā)酵生成與發(fā)酵液中的氮碳比有關(guān)［22］，因此，葡萄糖和酵母浸粉的添加量對發(fā)酵黑色素起到重要的作用，而發(fā)酵裝填量主要涉及發(fā)酵中的供氧。

4 結(jié) 論

研究利用發(fā)酵法制得的黑色素符合了黑色素的基本特征，不僅具有良好的水溶性，還具有較高的熱、酸堿穩(wěn)定性，并且對 H2O2和 NaClO有較好的耐受性及金屬離子對色素穩(wěn)定性影響不顯著。使用 Placket－Burman設(shè)計對發(fā)酵中的6個因素進(jìn)行篩選，得出葡萄糖、酵母浸粉和裝填量為影響黑色素產(chǎn)量的三個主要因素，通過響應(yīng)面優(yōu)化，得到最適宜發(fā)酵條件參數(shù)為：裝添量為100mL，葡萄糖10.3g／L，酵母浸粉2.02g／L，硫酸銨2.0g／L，NaCl 0.5g／L，接種量為2mL，pH自然，30℃，180 r／min搖床培養(yǎng)96 h，在此條件下最高產(chǎn)量可達(dá)0.53g／L。

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Study on the Optimization of Fermentation Conditions and Stability of Melanin from a Radiation－resistant Aureobasidium pullulans

ZHU Jing1，F(xiàn)ANG Shi－jie2，WANG Wei1，TANG Qi－yong1，ZHANG Zhi－dong1，ZHANG Li－juan1，GU Mei－ying1，SONG Su－qin1
（1．Research Institute of Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China；2．Scientific Research Management Office of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830016，China）

【Objective】Response surface analysis was applied in current study to optimize the fermentation process of water－soluble melanin produced by Aureobasidium pulluans strain MF1，and to assess the stability of the melanin.【Method】Three factors were determined to be most influential factors on melanin yield among all tested factors via Plackett－Burman design.Box－Behnken design was subsequentially applied to adjust the parameters during the fermentation.All analysis was processed in Design－expert 7.5 software.【Result】The fermentation achieved the highest melanin yield of 0.53g／L in raw broth with 100mL broth in 500mL flask，of which the glucose concentration was 10.3g／L，and yeast extract was 2.02g／L.The melanin yielded from our process was fair in water solubility，and was of high stability in heat，acid，alkaline，oxidation or reduction circumstance.Metal ions showed insignificant effect on pigment stability.【Conclusion】The results showed that the glucose，yeast extract and the filling amount were fundamental factors influencing the melanin fermentation produced with A．pulluans strain MF1.Our study laid foundation for the pilot scale，large－scale production of water－soluble natural melanin in the future.

melanin；Aureobasidium pullulans；response surface methodology；fermentation

S182

A

1001－4330（2016）09－1692－08

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.017

2016－03－03

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計劃（201511105）

朱靜（1981－），河南人，女，副研究員，碩士，研究方向為特殊環(huán)境微生物學(xué)，（E－mail）122543537＠qq.com

（Cotresponding author）：張志東（1977－），男，河南人，研究員，碩士，研究方向為特殊環(huán)境微生物學(xué)，（E－mail）zhangzheedong＠sohu.com

Fund project：Supported by Xinjiang HighTechnology Research and Development Program（Grant No.201511105）