偏腫栓菌內(nèi)生木霉菌株18-21抑菌效果研究

李 強(qiáng)， 李小林， 黃羽佳， 陳 誠(chéng)， 黃文麗， 熊 川， 鄭林用*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3.四川省技術(shù)創(chuàng)新促進(jìn)會(huì),四川 成都 610017)

?

偏腫栓菌內(nèi)生木霉菌株18-21抑菌效果研究

李 強(qiáng)1， 李小林2， 黃羽佳3， 陳 誠(chéng)1， 黃文麗1， 熊 川1， 鄭林用1*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3.四川省技術(shù)創(chuàng)新促進(jìn)會(huì),四川 成都 610017)

為了篩選獲得對(duì)植物根腐病及食用菌腐敗等有效的生防菌，采用抑菌圈法和對(duì)峙培養(yǎng)法篩選生防菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)和16S rDNA分子鑒定確定生防菌分類地位。從1株野生偏腫栓菌Trametesgibbosa子實(shí)體中分離獲得1株具有抑菌效果的生防菌，代號(hào)為18-21。篩選獲得的這株生防菌對(duì)植物根腐病及食用菌腐敗病原菌腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)的抑制率分別為56.7%、65.8%，并對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、側(cè)芽胞桿菌(Bacilluslatersprorus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)等病原細(xì)菌均具有顯著的抑菌效果，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分類鑒定，確定為漸綠木霉(Trichodermaviridescens)。研究結(jié)果拓寬了生防菌的分離材料來(lái)源，豐富了生防資源，具有很大的應(yīng)用潛力。

偏腫栓菌；內(nèi)生菌；生物防治；抑菌；鐮刀菌

目前化學(xué)殺菌劑是常用的植物病害防治方法，但長(zhǎng)期使用會(huì)使許多病原菌產(chǎn)生抗藥性，降低防病效果，頻繁、高濃度地使用會(huì)污染環(huán)境，超標(biāo)的殘毒還會(huì)威脅人類健康，限制了我國(guó)果蔬等農(nóng)產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯，影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，破壞生態(tài)平衡[1-2]。生物防治作為一種有前途的替代手段在世界范圍內(nèi)得到認(rèn)可，因此，大力開(kāi)展生物防治研究對(duì)于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展非常必要而又十分迫切[3-7]。內(nèi)生真菌是一個(gè)多樣性豐富的生物類群，在生物防治方面有著重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。植物內(nèi)生菌是篩選生防菌株的主要來(lái)源，目前，已篩選出多種能有效抵抗植物病原菌的生防菌株，并制成了多種生防制劑[8-10]。但尚未有學(xué)者從大型真菌中篩選具有生防潛力的菌株。很多大型真菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，具有抑菌、抗癌、抗氧化等多種生物學(xué)功效[11-13]。這其中一部分可能是大型真菌自身代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)，但也可能有內(nèi)生菌的參與。因此從大型真菌子實(shí)體中篩選出具有抑菌等生物活性的菌株，是一個(gè)創(chuàng)新的嘗試，可以拓寬生防菌株的分離材料來(lái)源，具有一定的研究潛力。偏腫栓菌Trametesgibbosa(Pers. : Fr.) Fr.是木生食用菌段木栽培的重要害菌之一，屬木腐菌，引起木材海綿狀白色腐朽。生于柞、榆、椴等樹(shù)木的枯木、倒木、木樁上。子實(shí)體中等至大，一年生，木栓質(zhì)，無(wú)柄，側(cè)生、單生或疊生，菌蓋多為半圓形、扁平。目前對(duì)偏腫栓菌的研究較少，尚未有人對(duì)其內(nèi)生菌群開(kāi)展研究。本研究以采集的野生偏腫栓菌為材料，從其子實(shí)體中分離內(nèi)生真菌，并篩選出對(duì)病原真菌三線鐮刀菌、腐皮鐮刀菌，病原細(xì)菌銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、側(cè)芽胞桿菌、表皮葡萄球菌具有抑制作用的真菌，進(jìn)行鑒定，并分析其系統(tǒng)發(fā)育地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 偏腫栓菌于2014年7月采自四川德昌縣(E 102°07′21″，N 27°23′48″，2 490 m)一株榆樹(shù)的枯木上，子實(shí)體用無(wú)菌袋封裝，冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保藏，用于內(nèi)生菌的分離。供試病原菌：三線鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、側(cè)芽胞桿菌。上述菌株均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，標(biāo)本保藏于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 內(nèi)生真菌分離及病原真菌對(duì)峙培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL)；病原細(xì)菌抑菌培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL)。

1.2 方法

1.2.1 偏腫栓菌子實(shí)體內(nèi)生菌的分離與純化 將采集的偏腫栓菌子實(shí)體用蒸餾水清洗干凈，放置于超凈臺(tái)晾干。將晾干的偏腫栓菌子實(shí)體用75%的酒精浸泡1～3 min，再用3%次氯酸鈉浸泡2 min，75%乙醇浸泡3 min。用無(wú)菌水沖洗3～4次，取最后一次清洗的無(wú)菌水100 μL涂布于 LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)72 h，檢測(cè)表面滅菌效果[14-15]。用無(wú)菌解剖刀剖開(kāi)偏腫栓菌子實(shí)體，用無(wú)菌鑷子取內(nèi)部組織0.5 g，置于滅菌的研缽中，加入2 mL無(wú)菌水，將其搗碎，吸取研磨液，稀釋平板涂布法涂布于分離培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)。劃線分離法對(duì)菌株進(jìn)一步純化分離，斜面4 ℃保存，根據(jù)形態(tài)特征對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 生防菌株的篩選 ①病原真菌生防菌株的篩選(平板對(duì)峙法)：將分離純化的內(nèi)生真菌與病原真菌分別通過(guò)打孔器(6 mm)取一小塊菌絲組織接種于PDA平板兩側(cè)，只接種病原菌不接內(nèi)生菌的平板做對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)，分別在3、5、7 d測(cè)量病原菌和生防菌的菌落直徑，對(duì)照病原菌的菌落直徑記錄生長(zhǎng)狀況，計(jì)算抑制率。抑制率的計(jì)算公式：抑制率(%)= ((對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑) / (對(duì)照病原菌菌落直徑-0.6))×100%。②病原細(xì)菌生防菌株的篩選：分別吸取病原細(xì)菌的菌液200 μL涂布于LB平板，用打孔器取分離純化的內(nèi)生真菌菌絲組織塊置于平板中央，30 ℃培養(yǎng)觀察，7 d后測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.3 生防菌株的分子鑒定 采用D3390-02 E.Z.N.A. TM Fungal DNA Kit(200)真菌DNA提取試劑盒(OMEGA)提取內(nèi)生真菌基因組DNA。真菌ITS序列擴(kuò)增采用通用引物：ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[16]，PCR采用50 μL反應(yīng)體系，其中2×TaqPCR Master Mix 25 μL， 10 μmol/L的引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶純化后送上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序。序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov)，用 Blast 軟件在GenBank網(wǎng)站上進(jìn)行相似性搜索，獲取相近典型菌株的ITS基因序列，用CLUSTAL-X進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.2.4 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 采用 BLAST 和 DNAMAN 序列分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列一致性分析，在GenBank中搜索同源序列，調(diào)出相關(guān)菌株的ITS序列片段，利用MEGA5進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor-Joining法，Maximum Composite Likelihood模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，Bootstrap(1 000 次) 重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 偏腫栓菌內(nèi)生真菌分離

取最后一次清洗的無(wú)菌水100 μL涂布于 LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)72 h，未發(fā)現(xiàn)菌落長(zhǎng)出，表明表面消毒成功，從偏腫栓菌子實(shí)體內(nèi)部組織中分離的菌株可判定為偏腫栓菌的內(nèi)生菌，共分離出5株內(nèi)生真菌，用于生防菌株的篩選。

2.2 病原真菌生防效果

從分離純化到的內(nèi)生真菌中，篩選出1株具有病原真菌抑菌效果的菌株18-21，該菌株對(duì)植物根腐病及松茸等食用菌病原菌三線鐮刀菌及腐皮鐮刀菌都有良好的抑菌效果(圖1)。由圖1可知，腐皮鐮刀菌與菌株18-21在平板中央形成了一條明顯的抑制帶，腐皮鐮刀菌菌落呈白色，絨毛狀，菌落突起，邊緣為全緣，未見(jiàn)孢子產(chǎn)生；而菌株18-21菌落呈白色，絨毛狀，兩者菌落邊緣接觸后，漸漸形成一條高低錯(cuò)落的抑制帶，此后，兩者的菌落均無(wú)法繼續(xù)擴(kuò)散或覆蓋對(duì)方菌落，7 d的抑制率為56.7%。同時(shí)，三線鐮刀菌與菌株18-21也形成了一條1～2 cm的抑制帶，并且在兩者菌落接觸邊緣有黃色色素產(chǎn)生，可能有拮抗物質(zhì)產(chǎn)生。7 d的抑制率為65.8%，并且三線鐮刀菌在對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中菌落有衰退的跡象，證明18-21對(duì)該菌的抑菌效果良好。

圖1 拮抗菌18-21的抑菌效果Fig.1 The inhibition effect of strain 18-21 against

2.3 病原細(xì)菌生防效果

分離純化到的內(nèi)生真菌18-21對(duì)病原細(xì)菌同樣具有明顯的抑菌效果。將6 mm的菌絲培養(yǎng)塊接種到涂滿病原細(xì)菌的LB平板中央，觀察發(fā)現(xiàn)，會(huì)形成一定直徑的抑菌圈。其中對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果最為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到(1.68±0.15) cm; 對(duì)表皮葡萄球菌的抑菌直徑達(dá)到(1.45±0.05) cm; 對(duì)枯草芽胞桿菌的抑菌直徑達(dá)到(1.18±0.09) cm；對(duì)側(cè)芽胞桿菌的抑菌直徑達(dá)到(0.78±0.10) cm(見(jiàn)表1)。

表1 拮抗菌18-21的抑菌效果

2.4 生防菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育

提取具有一定生防效果的菌株18-21的菌絲體DNA，擴(kuò)增后序列通過(guò)BLAST比對(duì)，其與菌株Hypocreaviridescenswxm60(HM051062)的相似度100%，可確定為漸綠木霉(Trichodermaviridescens)的有性世代。查找到相關(guān)菌株同源序列，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。確定了該菌株屬于木霉種群，進(jìn)一步豐富了木霉生防資源。

圖2 根據(jù)菌株18-21及其相關(guān)菌株的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the Neighbor-Joining approach based on the ITS gene of strain 18-21 and related strains

3 討 論

大量研究證明，內(nèi)生菌可以在寄主生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如促生、抑菌等，甚至影響寄主的產(chǎn)量與品質(zhì)[17-18]。同時(shí)，由于與寄主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，內(nèi)生菌已經(jīng)成為提取生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源[19-21]。但目前對(duì)內(nèi)生菌的研究主要集中于植物方面，對(duì)大型真菌的內(nèi)生菌研究則鮮有報(bào)道。很多大型真菌具有多種生物活性功能，從中分離出具有特殊功效的微生物，拓寬了功能微生物的分離材料來(lái)源，具有一定的研究潛力，同時(shí)也對(duì)實(shí)現(xiàn)珍貴野生食用菌馴化栽培具有一定意義。

本研究從偏腫栓菌子實(shí)體中分離出1株具有廣譜抗菌能力的菌株18-21。該菌株對(duì)植物及食用菌病原真菌三線鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和多種病原細(xì)菌都具有一定的抑制作用。腐皮鐮刀菌及三線鐮刀菌是多種植物及動(dòng)物的病原真菌，可引起植物根腐病、動(dòng)物角膜炎等病癥，同時(shí)還能導(dǎo)致松茸、塊菌等野生及栽培食藥用菌腐敗，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害極大[22]。本研究分離的生防菌株18-21，對(duì)這兩種病原真菌的抑菌效果甚至優(yōu)于部分經(jīng)常被用作生防的菌株，顯示出該菌株具有良好的應(yīng)用潛力。同時(shí)，由于該木霉菌株是從大型真菌中分離，與其他食用菌有相似的代謝環(huán)境，因此將其應(yīng)用于食用菌栽培中，用來(lái)防治食用菌的病原菌，具有良好的前景。

木霉菌是一個(gè)重要微生物種群，該種群具有較強(qiáng)的生命力。被廣泛用作生防菌株，并應(yīng)用于生物防治[23]。但以往對(duì)木霉生防潛力的研究，往往集中于哈茨木霉、綠色木霉、康氏木霉、鉤狀木霉、長(zhǎng)枝木霉5種[24]，很少有關(guān)于漸綠木霉生防潛力的報(bào)道。本研究分離的漸綠木霉18-21具有高效的生防潛力，拓寬了生防菌株的選擇范圍，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)木霉生防潛力的認(rèn)識(shí)。而且研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在拮抗時(shí)會(huì)產(chǎn)生1～2 cm的抑菌帶，并且產(chǎn)生一些色素，這可能是對(duì)峙過(guò)程中木霉菌株產(chǎn)生了抑制病原菌生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，也可能是木霉菌株改變病原菌的代謝途徑或代謝方式。關(guān)于其抑菌機(jī)理及抑菌化合物，有待進(jìn)一步研究。

[1] 劉佳,張建壘,王祥紅,等. 海洋生防酵母菌的篩選及對(duì)果實(shí)采后病害的防治[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(S1): 39-43.

[2] 孫宏偉, 元野, 楊曉敏, 等. 煙草野火病拮抗生防菌的篩選、鑒定與應(yīng)用[J]. 煙草科技, 2012,(8): 84-88.

[3] 王光華, Jos M.Raaijmakers. 生防細(xì)菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)及其在生物防治中的作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2004, 15(6): 1100-1104.

[4] 王靖, 郭巖彬, 王建輝, 等. 葡萄根癌生防菌株E26生防效果的離體檢測(cè)方法研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007,40(7): 1395-4102.

[5] 葛慈斌, 肖榮鳳, 曹宜,等. 生防菌ANTI-8098A對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌特性[J]. 中國(guó)生物防治, 2009, 25(4): 316-321.

[6] 魏彩燕，毛雪琴，柴榮耀，等. 草莓炭疽病生防菌株MT-06 的鑒定及生物學(xué)特性[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2010, 9(4): 481-487.

[7] 許秀蘭, 黃曉麗, 張翅, 等. 云杉內(nèi)生優(yōu)勢(shì)毛殼菌的篩選及其生防機(jī)制研究[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2014, 30(4): 511-519.

[8] 文才藝,吳元華,田秀玲. 植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問(wèn)題[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2004, 23(2): 86-91.

[9] 汪軍, 黃俊生. 植物內(nèi)生菌研究技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè), 2008, (5): 18-20.

[10]史應(yīng)武, 婁愷, 李春. 植物內(nèi)生菌在生物防治中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)雜志, 2009, 29(6): 61-64.

[11]Ding X, Tang J, Cao M. Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated fromTricholomamatsutake[J]. IntJBiolMacromol, 2010, 47(2): 271-275.

[12]Yin XL, You QH, Jiang ZH. Immunomodulatory activities of different solvent extracts fromTricholomamatsutake(S. Ito et S. Imai) singer (higher basidiomycetes) on normal mice[J]. Int J Med Mushrooms, 2012, 14(6): 549-556.

[13]Chen XQ, Wang QQ, Li JM. Comparison of simultaneous distillation and extraction, static headspace and headspace-solid phase microextraction coupled with GC/MS to measure the flavour components ofTricholomamatsutake[J]. Asian J Chem,2013, 25(11): 6059-6063.

[14]張雪兵, 史應(yīng)武, 王曉霞, 等. 醉馬草內(nèi)生菌的分離、鑒定及殺蟲效果[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2010, 50(4): 530-536.

[15]李強(qiáng), 李小林, 黃文麗, 等. 四川松茸內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 25(11): 3316-3322.

[16]劉春來(lái), 文景芝, 楊明秀, 等. rDNA-ITS在植物病原真菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 38(1): 101-107.

[17]張國(guó)霞, 茅慶, 何忠義, 等. 陵水普通野生稻 (Oryzarufipogon)內(nèi)生菌的固氮及溶磷特性[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2006, 12(4): 457-460.

[18]雍彬, 張超, 馬沁沁, 等. 華重樓內(nèi)生菌Iun35的分離及其抗菌蛋白的性質(zhì)[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2011, 13(4): 537-540.

[19]田新莉, 曹理想, 楊國(guó)武, 等. 水稻內(nèi)生放線菌類群及其對(duì)宿主病原菌的抗性研究[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2004, 44(5): 641-646.

[20]王秀呈, 曹艷花, 唐雪, 等. 水稻內(nèi)生固氮菌HerbaspirillumseropedicaeDX35的篩選及其促生特性[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(3): 292-298.

[21]楊本壽, 苗翠蘋, 張建華, 等. 飛龍斬血內(nèi)生菌種群分布及抑菌活性檢測(cè)[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(3): 276-284.

[22]魯占魁, 王國(guó)珍, 張麗榮, 等.枸杞根腐病的發(fā)生及防治研究[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 1994, 21(3): 249-254.

[23]張廣志，楊合同，張新建，等. 木霉現(xiàn)有種類名錄[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2014, 33(6): 1210-1230.

[24]田娜, 姚瑞麗, 張作剛, 等. 生防木霉菌的分離和篩選[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 33(4): 313-318.

Biocontrol Effect of Trichoderma viridescens Strain 18-21 Screened from Fruiting Bodies of Trametes gibbosa

LI Qiang1, LI Xiao-lin2, HUANG Yu-jia3, CHEN Cheng1,HUANG Wen-li1, XIONG Chuan1, ZHENG Lin-yong1

(1.Inst.ofSoil&Fert.., 2.Inst.ofBiol. &NuclearTechnol.,SichuanAcad.ofAgric.Sci.,Chengdu610066;3.Technol.Innov'nFound'nofSichuan,Chengdu610017)

In order to screen and obtain effective biocontrol microbes (BM) against plant root rot and rot of edible fungi, inhibition ring and confrontation culture methods were used to screen the BM. The classification site of the BM were identified according to the morphology characters and ITS sequence analysis．One BM isolated from wild fruiting bodies ofTrametesgibbosaand with the ability of inhibition the pathogen was obtained, coded name 18-21. The screened obtained BM had strong antagonism against plant root rot and edible fungi rot (FusariumsolaniandFusariumtricinctum) with inhibition rate at 56.7% and 65.8% respectively. It also had significant inhibition effects against pathogens likePseudomonasaeruginosa,Bacillussubtilis,Bacilluslatersprorus,Staphylococcusepidermidisetc. The strain was identified and classified asTrichodermaviridescensthrough morphology, molecular biology. The results of the study had widened the isolation material source of BM and enriched biocontrol resources, showing promising potential applications.

Trametesgibbosa; endophytes; biocontrol; inhibition;Fusarium

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013NZ0029，2014FZ0004)

李強(qiáng) 男，碩士研究生。主要從事資源微生物學(xué)研究。E-mail：leeq110@126.com

* 通訊作者。男，博士，研究員。主要從事食用菌學(xué)研究。E-mail:zly6559@126.com

2015-03-20；

2015-06-09

Q939.92

A

1005-7021(2016)01-0017-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.004