高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定蜂膠中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量

肖利龍，張鑫鑫，花 錦

（1.太原學(xué)院，山西太原 030032；2.山西出入境檢驗檢疫局，山西太原 030024）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定蜂膠中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量

肖利龍1，張鑫鑫2，花 錦2

（1.太原學(xué)院，山西太原 030032；2.山西出入境檢驗檢疫局，山西太原 030024）

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定蜂膠中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的方法。結(jié)果表明：在1～30μg/ L范圍內(nèi)氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素3 種目標(biāo)物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997；氯霉素的檢出限為0.01μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素的檢出限均為0.05μg/kg；3 種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為67.3%～121%、變異系數(shù)為0.82%～12.2%。該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏簡便，能夠滿足對蜂膠中氯霉素類藥物的殘留確證。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；氯霉素；甲砜霉素；氟甲砜霉素；蜂膠

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素為氯霉素類藥物，是預(yù)防和治療蜜蜂細菌性疾病的一類廣譜抗生素[1]。若蜂產(chǎn)品的原料收獲期使用氯霉素類藥物，將導(dǎo)致該類藥物大量殘留[2]。研究表明，氯霉素有較強的毒副作用，能夠?qū)е氯梭w再生障礙性貧血和嬰兒灰色綜合癥等疾病[3]。歐美等發(fā)達國家在其法規(guī)中規(guī)定食品中氯霉素不得檢出。為保證我國蜂膠的食用及外貿(mào)出口安全，建立一種準(zhǔn)確可靠、靈敏簡便的氯霉素類藥物殘留定性定量的方法是十分必要的。

目前，對于蜂膠中氯霉素的檢測報道很多[4-5]，而對多種氯霉素類藥物的同時測定，國內(nèi)外尚未見報道。本試驗采用HPLC-MS/MS法建立了蜂膠中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的定性定量檢測方法。為縮短測定周期和消除基質(zhì)干擾，對萃取和洗脫條件進行了優(yōu)化。本試驗方法靈敏準(zhǔn)確，簡便快速，重現(xiàn)性好，能夠滿足蜂膠進出口檢測的要求。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（CAP）、甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品（TAP）、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品（FF）純度均≧99.9%，Dr Ehrenstorfer GmbH；乙酸乙酯、正己烷、無水硫酸鈉、醋酸鉛和乙醇均為分析純；水為超純水；甲醇為色譜純；25%氨水（1mL 氨水加入到3mL 純凈水中混勻）；堿化乙酸乙酯：乙酸乙酯/25%氨水=97/3（體積比）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜儀：Waters超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（ACQUITYTMUPLC/TQ Detector）；渦旋振蕩器；離心機：4 000r/min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；Oasis HLB固相萃取小柱：500mg；10mL容量瓶；微孔濾膜：0.45μm；Millipore純水機。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱取0.010 0g氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，1～4℃冰箱保存。根據(jù)所需用流動相配制成一系列適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理

稱取2g蜂膠粉末（精確到0.01g）置于50mL具塞離心管中，加入5mL乙醇，超聲處理20min，使蜂膠徹底溶解。加入10mL 水于渦旋混合器上2 000r/min渦旋3min，加10mL4%醋酸鉛溶液，2 000r/min渦旋振蕩2min，靜置10min，然后3 000r/min離心5min，過濾，提取液置于50mL離心管中。樣品殘渣中再加入10mL4% 醋酸鉛溶液，2 000 r/min渦旋振蕩2min，靜置10min，3 000 r/min離心5min，過濾，提取液合并至50mL離心管中。合并提取溶液中加入20mL堿化乙酸乙酯，渦旋 1min，2 500r/min離心 3min，取上層乙酸乙酯溶液到20mL玻璃試管中并在50℃以下水浴減壓濃縮至近干。依次用4mL正己烷和4mL水將殘渣轉(zhuǎn)移至10mL具塞玻璃離心管中，并于2 000r/min渦旋振蕩1 min，然后2 000r/min離心3min。上層正己烷溶液棄去，再加4mL正己烷，重復(fù)上述操作。水層轉(zhuǎn)移至Oasis HLB固相萃取小柱，再用10mL水分次洗滌離心管，洗滌液過HLB小柱，棄去流出液，用6mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，加水定容至10mL，混勻，通過0.45μm濾膜（5.7），供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 色譜測定條件

色譜柱：Eclipace XDB-C18，5μm，150mm×4.6mm（i.d.）流動相梯度洗脫程序見表1。流速：800μL/min；進樣量：8μL；色譜柱溫度：20℃。

表1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

根據(jù)氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素三個目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)特征，將1μg/mL的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇ESI負離子電離模式，進行一級質(zhì)譜母離子全掃描。測定氯霉素、甲砜霉素、和氟甲砜霉素的分子離子分別為 m/ z 321.0，354.0和355.8，然后以測出的分子離子作為母離子，進行子離子掃描，結(jié)果見圖1。在這種質(zhì)譜條件下，氯霉素主要產(chǎn)生m/z 257.0，121.0，175.9和152.0等子離子；甲砜霉素主要產(chǎn)生m/z290.0和184.8等子離子；氟甲砜霉素主要產(chǎn)生m/ z335.7和184.9等子離子。各目標(biāo)物選用離子豐度最強的碎片離子作為定量離子，豐度次強的碎片離子作為定性離子。為了得到最佳質(zhì)譜條件，對錐孔電壓和碰撞能量進行配比優(yōu)化，從而使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳，結(jié)果見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于弱極性化合物，為目標(biāo)物的色譜峰得到較好的分離效果，本試驗對 Symmety C18色譜柱和Eclipace XDB-C18色譜柱進行比較。結(jié)果表明：以水-甲醇為流動相，采用梯度洗脫的方式，流速為800μL/min，在8min內(nèi)，氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素均得到了較好的分離。所得色譜圖見圖2。

表2 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的優(yōu)化質(zhì)譜條件

圖1 氯霉素（1）、甲砜霉素（2）和氟甲砜霉（3）子離子全掃描質(zhì)譜

圖2 蜂膠中氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量色譜圖

2.3 線性范圍和靈敏度

氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素為內(nèi)標(biāo)，配制0.1～50ng/ mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值 Y 為縱坐標(biāo)，工作溶液的質(zhì)量濃度ρ（μg/L）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，3種目標(biāo)物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997，符合要求。以信噪比（S/N）為5，確定為方法的檢出限，所得數(shù)據(jù)見表3。

Simultaneous Determination of Residues of ChlorampHenicol，hiampHenicol and Florfenicol in Propolis By Hplc-Ms/Ms

Xiao Li-long，Zhang Xin-xin，Hua Jin

A method has been developed for the determination of ChlorampHenicol，ThiampHenicol and Florfenicol in Propolis by High performance liquid chromatograpHy-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The calibration curve of target was linear in the range of 1～30μg/L with correlation coefficients not less than 0.997.The detection limits of this method were 0.01μg/ kg for chlorampHenicol and 0.03μg/kg for thiampHenicol and florfenicol.The average recoveries were oranged from 67.3%～129% with relative standard deviations of0.82%～15.2%.The method is simple，reliable，sensitive，accurate and was suitable for the determination and confirmation of chlorampHenicol，thiampHenicol and florfenicol residues in Propolis.

HPLC-MS/MS；ChlorampHenicol；ThiampHenicol；florfenicol；propolis

TS254.7

A

1003–6490（2016）09–0073–03

2016–08–18

肖利龍（1986—），男，山西太原人，助教，主要研究方向為食品科學(xué)。