人源肺細(xì)胞cDNA文庫(kù)構(gòu)建及與流感病毒NP 互作宿主蛋白的篩選

羅維玉，朱鵬陽(yáng)，張 杰，胡永浩，孔暉暉，梁立濱，周 圓，李呈軍，姜 麗，陳化蘭

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人源肺細(xì)胞cDNA文庫(kù)構(gòu)建及與流感病毒NP 互作宿主蛋白的篩選

羅維玉1,2，朱鵬陽(yáng)2，張 杰2，胡永浩1，孔暉暉2，梁立濱2，周 圓2，李呈軍2，姜 麗2，陳化蘭1,2

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150001）

【目的】構(gòu)建肺組織細(xì)胞Calu-3及A549的高質(zhì)量酵母cDNA文庫(kù)并篩選與流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子，為深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒復(fù)制及致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。【方法】提取等量Calu-3及A549細(xì)胞的總RNA，混合后反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用長(zhǎng)距離PCR（LD-PCR）擴(kuò)增合成dscDNA，用CHROMA SPINTM+TE-400 純化柱純化dsDNA，按照Clontech公司的Make Your Own“Mate &Plate”Library System操作程序，將帶有同源臂的dscDNA與線性化pGADT7-Rec共同轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD/-Leu平板后于30℃培養(yǎng)4d左右，收集所有菌落，混勻分裝即為Calu-3和A549 細(xì)胞cDNA的酵母文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)庫(kù)容、滴度及多樣性進(jìn)行分析。利用RⅠ和HⅠ雙酶切將A/Auhui/2/2005（H5N1）NP定向插入pGBKT7載體，構(gòu)建高致病性流感病毒NP的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NP，經(jīng)驗(yàn)證該質(zhì)粒無(wú)自激活活性，并進(jìn)一步采用構(gòu)建完成的Calu-3/A549 細(xì)胞酵母文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選，篩選得到的正確閱讀的獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Y2H Gold酵母菌，分別以BD-P53/AD-T7作為陽(yáng)性對(duì)照和BD-Lam/AD-T7作為陰性對(duì)照，挑取最終在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α -gal/AroA(SD/-4/X/A) 固體培養(yǎng)板上生長(zhǎng)良好且變藍(lán)的菌落，即為候選與目標(biāo)蛋白互作陽(yáng)性的蛋白，提取酵母質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序分析、序列比對(duì)和Gene Ontology分析。【結(jié)果】提取兩種細(xì)胞RNA 28S與18S條帶清晰，5S條帶暗淡，表明所提RNA質(zhì)量較高，基本無(wú)降解；對(duì)提取的RNA反轉(zhuǎn)錄純化獲得dscDNA，dscDNA條帶呈彌散狀，片段大小分布于500—2 000bp之間，說(shuō)明不同豐度及大小的RNA均成功反轉(zhuǎn)錄；構(gòu)建的dscDNA文庫(kù)庫(kù)容為1.5×107，滴度為2.2×108cfu/mL，重組率為88%，PCR鑒定文庫(kù)插入片段，條帶大小不一、多樣性好；利用誘餌質(zhì)粒與文庫(kù)進(jìn)行雙雜交篩選，回交驗(yàn)證后得到11個(gè)與NP蛋白互作的宿主因子。經(jīng)Gene Ontology分析顯示，11個(gè)宿主因子參與的生物過(guò)程包括：細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、可變剪接、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及細(xì)胞增殖等；涉及的分子功能包括：GTP結(jié)合活性、金屬離子結(jié)合活性、DNA結(jié)合活性及轉(zhuǎn)錄因子活性?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建同時(shí)含有Calu-3和A549兩種人源肺細(xì)胞cDNA的酵母文庫(kù)，文庫(kù)覆蓋cDNA更全面，為后期篩選與流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基礎(chǔ)，篩選得到與NP蛋白存在相互作用的宿主因子為進(jìn)一步深入研究NP功能提供了可靠的前期數(shù)據(jù)。

流感病毒；NP蛋白；cDNA文庫(kù)構(gòu)建；酵母雙雜交系統(tǒng)；宿主因子

0 引言

【研究意義】流感病毒是重要的人獸共患傳染病病原，可以在不同宿主間循環(huán)存在，不斷發(fā)生突變及重組，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康，并對(duì)經(jīng)濟(jì)造成沉重負(fù)擔(dān)[1]。酵母雙雜交技術(shù)在篩選與研究與已知蛋白相互作用的未知蛋白方面得到了廣泛的應(yīng)用，利用該技術(shù)構(gòu)建覆蓋面廣的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，并鑒定與流感病毒蛋白發(fā)生直接相互作用的宿主蛋白，對(duì)深入理解流感病毒的復(fù)制和致病機(jī)制，創(chuàng)新抗流感病毒藥物和療法具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】A型流感病毒的基因組由8條單股負(fù)鏈RNA組成，已經(jīng)報(bào)道可編碼多達(dá)18種蛋白[2]，根據(jù)表面蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原性的不同分為18個(gè)HA亞型和11個(gè)NA亞型[3]。流感病毒的基因組極易發(fā)生變異，一方面，病毒基因組的分節(jié)段特性使得不同病毒在感染同一細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生病毒間基因片段的交換而產(chǎn)生新的基因重組病毒[4]，另一方面，由于病毒的RNA聚合酶缺乏校正功能導(dǎo)致病毒在復(fù)制的過(guò)程中很容易發(fā)生基因突變[5]。流感病毒的高突變率和易于發(fā)生基因重組的特性導(dǎo)致流感病毒的抗原變異頻繁，為以疫苗免疫為主的防控措施帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)。藥物治療是除了疫苗以外的另一種抗流感病毒策略。目前，針對(duì)流感病毒NA蛋白設(shè)計(jì)的藥物奧塞米韋和扎那米韋在臨床治療方面發(fā)揮了顯著的作用[6-7]。但在用藥過(guò)程中，病毒的神經(jīng)氨酸酶基因可能會(huì)發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性毒株，導(dǎo)致藥物失去治療效果[8-9]。為此，需要加強(qiáng)流感病毒的復(fù)制周期調(diào)控機(jī)制研究，揭示流感病毒生命周期中所依賴的宿主蛋白，為抗流感藥物的研發(fā)提供新思路和潛在的靶標(biāo)。截至目前，利用不同方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與流感病毒蛋白互作而影響病毒復(fù)制的宿主蛋白[10-11]。對(duì)于NP蛋白而言，它在病毒RNA合成、復(fù)制復(fù)合體運(yùn)輸和子代病毒包裝等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NP蛋白作為流感病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，是組成病毒核糖核蛋白復(fù)合體vRNP的成分[12]，在整個(gè)流感病毒生命周期發(fā)揮重要的作用，參與vRNP的入核[13]、病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、與M1蛋白和NEP蛋白一起介導(dǎo)vRNP出核[13-15]。而且，NP蛋白在不同亞型流感病毒中非常保守[16]，可以作為抗流感藥物的良好靶標(biāo)。因此，與流感病毒NP蛋白互作宿主因子的研究也就自然成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前，利用不同方法發(fā)現(xiàn)的與NP蛋白互作的宿主蛋白包括有：DDX3[17]、MOV10[18]、importin α[19]、CRM1[20]、UAP56[21]和Tat-SF1[22]等。【本研究切入點(diǎn)】鑒于NP蛋白是流感病毒粒子中除M1蛋白以外含量最高的病毒蛋白且在病毒復(fù)制周期的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，挖掘與流感病毒NP蛋白互作的宿主蛋白具有重要意義。因此，本研究以流感病毒的NP蛋白為研究對(duì)象，力圖發(fā)掘病毒復(fù)制周期中與NP蛋白互作的新的宿主因子。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】系統(tǒng)深入的了解與NP作用的宿主蛋白，需要構(gòu)建覆蓋基因更全面的文庫(kù)。為此，本研究成功構(gòu)建了同時(shí)含有肺泡上皮細(xì)胞A549和肺腺癌細(xì)胞Calu-3兩種肺臟細(xì)胞類型的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，并利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與流感病毒NP蛋白互作的宿主因子，為研究流感病毒復(fù)制和致病機(jī)制及設(shè)計(jì)針對(duì)NP和宿主因子的抗流感藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所完成。

1.1 主要試劑

Rneasy Plus Mini kit RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；酵母質(zhì)粒小提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司；Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN 公司；酵母文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、各種酵母培養(yǎng)基及Aureobasidin A和X-α-gal均購(gòu)自Clontech公司。

1.2 RNA提取及第一鏈cDNA合成

采用RNeasy Plus Mini kit試劑盒，按說(shuō)明書步驟提取等量A549細(xì)胞和Calu-3細(xì)胞總RNA。在無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管中分別加入2 μg新提取的細(xì)胞總RNA和1 μmol·L-1primer，用RNase-free H2O補(bǔ)至總體積4 μL；72℃水浴熱激2 min，冰上冷卻2 min，13 000×g瞬時(shí)離心10 s；加入2 μL 5×First-Strand Buffer、1 μL 100 mmol·L-1DTT、1 μL 10 mmol·L-1dNTP、1 μL SMART MMLV，混勻，42℃水浴10 min；加入1 μmol·L-1SMART III-modified oligo，混勻后42℃繼續(xù)孵育1 h，然后75℃ 10 min 終止反應(yīng)；室溫冷卻后，加入1 μL RNase H（2 個(gè)活性單位），37℃孵育20 min。

1.3 dscDNA 的長(zhǎng)距離PCR（LD-PCR）擴(kuò)增合成及其純化

按照表1加入cDNA模板和各種反應(yīng)試劑。按照以下擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10 s，68℃ 6 mina，26個(gè)循環(huán)（a表示每增加一個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間都要增加5 s）；68℃延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。最后，用CHROMA SPINTM+TE-400 純化柱純化dsDNA。

表1 LD-PCR擴(kuò)增體系

1.4 Y187酵母感受態(tài)制備

Y187 酵母菌株劃線于YPDA固體培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)；挑取單菌落于3 mLYPDA液體培養(yǎng)基中，30℃ 250 r/min震蕩培養(yǎng)，待OD600≈0.3時(shí)，700×g室溫離心5 min，棄去上清；以100 mL新鮮YPDA液體培養(yǎng)基重懸菌體，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.5，700×g離心5 min后以30 mL滅菌水重懸菌體，700×g離心5min收集菌體；1.5 mL 1.1×TE/ LiAc溶液重懸菌體，13 000×g高速離心30s，用600 μL 1.1×TE/ LiAc的溶液重懸即為酵母感受態(tài)。

1.5 dscDNA與pGADT7-Rec轉(zhuǎn)化及同源重組

Carrier DNA 95℃ 5 min后置于冰上10 min，如此反復(fù)2次備用；將pGADT7-Rec、純化的dscDNA、預(yù)變性的Carrier DNA及制備好的Y187感受態(tài)于無(wú)菌15 mL離心管中混勻；加入2.5 mLPEG/LiAc混勻后于30℃孵育45 min（每15 min搖勻一次）；加入160 μL DMSO混勻，42℃水浴20 min（每10 min搖勻一次）；室溫700×g離心5 min后用3 mL YPD Plus重懸沉淀；30℃震蕩培養(yǎng)90 min后700×g離心收集菌體，再以15 mL 0.9% NaCl溶液重新懸浮。取100 μL進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別取100 μL稀釋10倍及100倍的菌液涂于SD/-Leu 100 mm固體培養(yǎng)板，計(jì)算文庫(kù)容量，剩余樣品涂布于70 個(gè)150 mm的SD/-Leu 培養(yǎng)板上。30℃倒置培養(yǎng)3d左右直至菌落出現(xiàn)。

1.6 文庫(kù)收集及滴度測(cè)定

將1.5中已經(jīng)長(zhǎng)出菌落的平板置于4℃過(guò)夜冷卻；每個(gè)平板加入15個(gè)玻璃珠及5 mL的凍存培養(yǎng)液，輕輕搖晃收集所有菌體，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)到2×107/mL，1 mL分裝凍存。取100 μL文庫(kù)稀釋10-2、10-4、10-5、10-64個(gè)稀釋度，各取100 μL涂于100 mm SD/-Leu平板上，30℃培養(yǎng)3 d，菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算文庫(kù)滴度：克隆數(shù)目/稀釋混合物涂板體積×稀釋倍數(shù)=cfu/mL。隨機(jī)挑取24個(gè)菌落以ExTaq進(jìn)行PCR鑒定，判定文庫(kù)多樣性及計(jì)算重組率。

1.7 構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NP及誘餌菌株

以A/Anhui/2/2005（H5N1）病毒的NP表達(dá)質(zhì)粒pBD-NP為模板，用NP基因正向引物BD-NP-F（gcatatGAATTCATGGCGTCTCAAGGCAC）及反向引物BD-NP-R（gcaaatGGATCCTTAATTGTCATACT CCTCTGC），用prime STAR高保真DNA聚合酶擴(kuò)增NP全長(zhǎng)；對(duì)NP擴(kuò)增片段及pGBKT7載體進(jìn)行RI和HI雙酶切，連接轉(zhuǎn)化后涂于卡那抗性（50 μg·mL-1）的LB固體培養(yǎng)板上，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR及質(zhì)粒測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，涂布SD/-Trp固體培養(yǎng)板，單菌落加入500 μL含有25%甘油的YPDA培養(yǎng)液中凍存?zhèn)溆?。共轉(zhuǎn)化pGBKT7-53和pGADT7-T作為陽(yáng)性對(duì)照，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-Lam和pGADT7-T作為陰性對(duì)照，共轉(zhuǎn)化pGADT7和pGBKT7-NP后分別涂布到SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/X-α-gal/AbA檢測(cè)誘餌質(zhì)粒自激活。

1.8 誘餌菌株與文庫(kù)雜交

凍存的誘餌菌株于SD/-Trp固體培養(yǎng)板上劃線培養(yǎng)2—3 d；挑取單菌落于50 mL SD/-Trp培養(yǎng)液中至OD600≈0.8，離心收集誘餌菌株后用5—6 mLSD/ -Trp培養(yǎng)液重懸，于2 L錐形瓶中同時(shí)加入一支1 mL的文庫(kù)，再加入45 mL 2×YPDA，混勻；避光，30℃、40 r/min搖晃培養(yǎng)進(jìn)行雜交，24 h后離心收集菌體；10 mL 0.5×YPDA重懸菌體，均勻涂布40個(gè)150 mm的SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（SD/-4）固體培養(yǎng)板上；挑取單個(gè)菌落重新劃線到SD/-Trp/ -Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AroA（SD/-4/X/A）固體培養(yǎng)板上，挑取變藍(lán)且長(zhǎng)粗的菌落到4—5 mL SD/ -Trp/-Leu（SD/-2）液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min培養(yǎng)，準(zhǔn)備提取質(zhì)粒。

1.9 酵母質(zhì)粒的提取及回交驗(yàn)證

按照碧云天酵母質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取酵母質(zhì)粒，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至DH5α，利用Axygen 質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，Blast序列比對(duì)。篩選正確閱讀的獵物質(zhì)粒，將獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒各500ng共同轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)菌株中，涂布SD/-2、SD/-4和SD/-4/X/A固體培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3—7d，觀察生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 Calu-3細(xì)胞及A549細(xì)胞總RNA電泳

提取calu-3及A549細(xì)胞RNA濃度分別為1 023和967 ng?μL-1，OD260/OD280≈1.8，OD260/OD230≈2.0說(shuō)明提取RNA純度較高，蛋白以及其他離子污染較少；28S與18S條帶清晰，5S條帶暗淡，說(shuō)明RNA基本沒(méi)有降解，適合文庫(kù)構(gòu)建的后續(xù)試驗(yàn)（圖1）。

M：DL2000 Marker；1：Calu-3細(xì)胞總RNA；2：A549細(xì)胞總RNA

2.2 dscDNA的鑒定

提取RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以LD-PCR擴(kuò)增合成dscDNA，利用CHROMA SPIN+TE-400對(duì)其進(jìn)行純化。1%核酸電泳顯示dscDNA條帶于500—2 000 bp之間呈彌散狀（圖2），說(shuō)明不同豐度和不同大小的RNA均被反轉(zhuǎn)錄，可以用于文庫(kù)構(gòu)建。

2.3 庫(kù)容及滴度測(cè)定

將收集的文庫(kù)以10倍倍比稀釋后，取10-2、10-4、10-5、10-6四個(gè)稀釋度各100 μL涂于100 mm SD /-Leu平板上。菌落計(jì)數(shù)106稀釋度有22個(gè)菌落，計(jì)算所建文庫(kù)滴度為2.2×108cfu/mL（圖3）。轉(zhuǎn)化pGADT7-Rec和dscDNA的Y187菌液做1﹕10及1﹕100稀釋，涂于SD/-Leu平板上，計(jì)算所建文庫(kù)的庫(kù)容為1.5×107，滿足酵母雙雜交試驗(yàn)的建庫(kù)要求。

M：DL2000 Marker；1：純化的dscDNA

酵母菌液分別稀釋至(A)10-2、(B)10-4、(C)10-5和(D)10-6在SD/-Leu平板上的生長(zhǎng)情況，用于計(jì)算文庫(kù)滴度

2.4 文庫(kù)PCR鑒定

一方面，利用多種形式宣傳造勢(shì)企業(yè)管理制度。移動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的普遍，給中小企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者開(kāi)辟了新的管理方式?？梢岳靡苿?dòng)網(wǎng)絡(luò)形式開(kāi)展管理制度學(xué)習(xí)的比賽，或收集對(duì)企業(yè)管理制度的意見(jiàn)和對(duì)企業(yè)組織發(fā)展的想法建議等，以求企業(yè)員工理解管理制度，明確制度的意義，認(rèn)可制度，使得企業(yè)管理工作正常進(jìn)行，管理制度能夠得以貫徹落實(shí)。

隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小分布在250—2 000 bp之間，且片段長(zhǎng)度并不均一，24個(gè)克隆僅有3個(gè)沒(méi)有檢測(cè)到插入片段，重組率達(dá)到88%（圖4），上述結(jié)果表明構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的酵母雙雜交試驗(yàn)。

2.5 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NP的PCR鑒定和序列分析

挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而后提取質(zhì)粒，以NP特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與NP基因全長(zhǎng)（1 565 bp）相近的DNA片段，對(duì)擴(kuò)增大小正確的質(zhì)粒進(jìn)一步測(cè)序分析，結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.6 回交驗(yàn)證

篩選得到的正確閱讀的獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Y2H Gold酵母菌，分別以BD-P53/AD-T7作為陽(yáng)性對(duì)照和BD-Lam/AD-T7作為陰性對(duì)照，經(jīng)過(guò)篩選鑒定共發(fā)現(xiàn)11個(gè)獵物質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)后在SD/-Trp/- Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AroA（SD/-4/X/A）培養(yǎng)板上呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果（圖6），即蛋白間存在相互作用。所篩選得到的與流感病毒NP蛋白互作的宿主蛋白的編碼基因信息見(jiàn)表2。

2.7 Gene Ontology分析

利用在線網(wǎng)站https://david.ncifcrf.gov/對(duì)篩選得到的宿主因子進(jìn)行Gene Ontology（GO）分析，結(jié)果顯示11個(gè)宿主因子共參與7個(gè)生物過(guò)程，分別是：細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、可變剪接、多態(tài)性、金屬結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)；分子功能有4種，包括GTP結(jié)合活性、金屬離子結(jié)合活性、DNA結(jié)合活性及轉(zhuǎn)錄因子活性。具體信息見(jiàn)表3。

M：DL2000 Marker；1-24：樣品編號(hào) M：DL2000 Marker；1-24：Sample number

表2 篩選得到與流感病毒NP互作蛋白的編碼基因

表3 與NP蛋白相互作用蛋白GO分析

M：DL2000 Marker；1：誘餌質(zhì)粒PCR產(chǎn)物

圖6 獵物與誘餌在Y2H Gold中的相互作用

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是一種被廣泛用于研究蛋白質(zhì)相互作用的成熟方法，該方法不需純化蛋白，避免蛋白變性；接近于體內(nèi)環(huán)境，能夠比較真實(shí)反應(yīng)機(jī)體內(nèi)蛋白相互作用的情況；靈敏度非常高，對(duì)于蛋白之間非常微弱、瞬間發(fā)生的互作也能夠篩選到；具有篩選量大、效率高及應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)[23]。

流感病毒是有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，其病毒基因組分為8個(gè)節(jié)段，可編碼多達(dá)18種蛋白。核蛋白NP由vRNA片段5編碼，全長(zhǎng)498個(gè)氨基酸，在中性pH條件下帶正電荷，對(duì)RNA具有很強(qiáng)的結(jié)合力[24]。NP蛋白在結(jié)構(gòu)上分為頭部結(jié)構(gòu)域、主體結(jié)構(gòu)域和尾部結(jié)構(gòu)域[25]。NP蛋白作為流感病毒核糖核蛋白復(fù)合體vRNP的重要組分，在不同亞型的流感病毒中相當(dāng)保守，在病毒復(fù)制周期的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用[26]。因此，通過(guò)挖掘與流感病毒NP蛋白互作的宿主蛋白，不僅可以深入了解宿主蛋白參與流感病毒復(fù)制周期調(diào)控的機(jī)制，而且有可能發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶標(biāo)，為研制新型抗流感病毒藥物以及干預(yù)治療提供理論依據(jù)。本研究構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NP進(jìn)行酵母雙雜交篩選，回交驗(yàn)證得到11個(gè)與其互作的宿主因子。這些蛋白具有多種分子功能，參與多個(gè)生物過(guò)程，但與病毒相關(guān)的研究仍相對(duì)較少。對(duì)這些NP互作蛋白的深入研究，將深化人們對(duì)NP蛋白功能、流感病毒感染和致病機(jī)制等的認(rèn)知，并促進(jìn)防控策略和手段的創(chuàng)新。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了高質(zhì)量A549/Calu-3細(xì)胞cDNA的酵母雙雜交文庫(kù)，并以誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NP篩選到11個(gè)與流感病毒NP蛋白存在相互作用的宿主蛋白，為進(jìn)一步研究NP蛋白功能及流感病毒致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Construction of cDNA Library Derived from Human Lung Epithelial Cell Lines and Screening for Host Cellular Proteins Interacting with Influenza Virus Nucleoprotein

LUO Wei-yu1,2, ZHU Peng-yang2, ZHANG Jie2, HU Yong-hao1, KONG Hui-hui2, LIANG Li-bin2, ZHOU Yuan2, LI Cheng-jun2, JIANG Li2,CHEN Hua-lan1,2

(1College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;2State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute/Animal Influenza Laboratory of the Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001)

【Objective】In order to study the biological function of influenza virus nucleoprotein and provide a basis for the understanding of mechanism of influenza virus replication and pathogenesis, a yeast two-hybrid library derived from human lung epithelial cell lines Calu-3and A549 was constructed, and the host factors that interact with nucleoprotein (NP) of influenza virus were screened. 【Method】Total RNA was extracted from equal numbers of Calu-3 and A549 cells and their cDNA was synthesized by reverse transcription. Double strand cDNA (dscDNA) was amplified by long-distance PCR (LD-PCR) and purified through CHROMA SPINTM+TE-400 column according to the user manual of Make Your Own “Mate & Plate” Library System (Clontech). The purified dsDNA containing homologous arms was transformed into component Y187 yeast cells together with linearized pGADT7-Rec plasmid, and then the samples were incubated on SD/-Leu plates at 30℃ for about 4 days. All colonies were harvested and aliquoted, resulting in the construction of yeast two-hybrid library of Calu-3 and A549 cells. The library quality was evaluated by capacity, titer, recombination efficiency and diversity. Meanwhile, theRI andHI digested NP gene from influenza virus A/Anhui/2/2005 (H5N1) was inserted into pGBKT7 vector to generate the bait plasmid, which was further demonstrated without self-activating activity. The bait plasmid pGBKT7-NP was transformed into Y2H-Gold yeast strain, and then used to screen for interacting proteins from the yeast two-hybrid library. The selected pray plasmids with correct encoding insert and bait plasmids were co-transformed into the yeast cells, with BD-P53/AD-T7 and BD-Lam/AD-T7 plasmids as positive and negative controls, respectively. The blue colonies that grew well in medium containing SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AroA(SD/-4/X/A) were selected as candidate containing potential interacting partners of NP. After plasmid extraction and sequencing analysis, these candidates were annotated and classified by Blast and Gene Ontology (GO) analyses. 【Result】Analysis of RNA extracted from the two types of cells showed that both 28S and 18S RNA bands were clear whereas 5S band was faint, indicating that high quality RNA was obtained with almost no degradation. The dscDNA reverse transcribed from RNA was evenly dispersed on the gel with sizes ranged mostly between 500 and 2000 bp, demonstrating that RNA with different abundance and sizes were successfully reverse transcribed. The capacity and titer of the established yeast two-hybrid library were 1.5×107and 2.2×108cfu/mL, respectively, with 88% recombination efficiency and sufficient diversity. The screening of the library with the NP bait revealed 11 candidate interacting proteins. Through gene ontology analysis, it was found that these proteins are involved in several biological processes including regulation of cell apoptosis, embryonic development, alternative splicing, transcription regulation translation, metabolic process, regulation of cell proliferation. In addition, the molecular functions of these proteins included GTP binding, metal ion binding, DNA binding and transcription factor activity.【Conclusion】In conclusion, the yeast two-hybrid library containing Calu-3 and A549 cells was successfully constructed, which laid a foundation for the screening of host factors interacting with other influenza virus proteins, and the identification of 11 potential interacting host factors provided preliminary data for further study of the biological function of influenza virus NP protein.

influenza virus; NP protein; cDNA library construction; yeast two-hybrid (Y2H) system; host factor

2016-04-22；接受日期：2016-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31521005）

羅維玉，E-mail：lwy365946758@163.com。通信作者陳化蘭，E-mail：chenhualan@caas.cn；通信作者姜麗，E-mail：jiangli@caas.cn