調(diào)節(jié)黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的探索

詹美榕，丁俊竹，叢方地，，邢克智，周文禮，張樹(shù)林

（1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院生物制藥系，天津300384； 2.天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

調(diào)節(jié)黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的探索

詹美榕1，丁俊竹1，叢方地1，2，邢克智2，周文禮2，張樹(shù)林2

（1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院生物制藥系，天津300384； 2.天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

為提高己酸乙酯的酶促合成效果，通過(guò)物理吸附，將黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger Lipase,ANL）固定在柱形玻璃瓶的內(nèi)壁上，形成簡(jiǎn)易的生物反應(yīng)器，用于催化己酸和無(wú)水乙醇反應(yīng)，合成己酸乙酯。在己酸與乙醇的體積比為0.6∶3.5的無(wú)溶劑體系中，酶的用量占反應(yīng)體系0.24%，反應(yīng)條件為37℃、160 r/min。研究表明，固定化過(guò)程中，水可以優(yōu)化ANL的催化活性，羧甲基纖維素CMC能更好地優(yōu)化ANL。在催化過(guò)程中，無(wú)水硫酸鈉可以通過(guò)吸水作用，拉動(dòng)平衡增大轉(zhuǎn)化率，無(wú)水碳酸鈉可中和己酸，進(jìn)一步提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)時(shí)間24 h，轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)91.0%。

己酸乙酯； 脂肪酶； 固定化； 催化活性； 非水相

己酸乙酯是符合我國(guó)食品衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)的食用香料，用途十分廣泛[1]，尤其它是濃香型白酒的主體香味成分[2]，市場(chǎng)需求量極大[3]，需要通過(guò)合成來(lái)提供[4]。合成己酸乙酯通常采用的化學(xué)催化合成法，副產(chǎn)物多，后期處理困難且嚴(yán)重腐蝕實(shí)驗(yàn)設(shè)備，對(duì)環(huán)境也有嚴(yán)重污染[5]。而酶催化合成法，具有效率高、有選擇性及條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[6]因此，此法副產(chǎn)物少、環(huán)境友好且對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求[7]用于合成己酸乙酯時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量高，香味醇正[8]。特別是非水相中的脂肪酶催化方法[9]，利于酯的形成，用于合成己酸乙酯更為方便[10]。脂肪酶催化合成己酸乙酯多使用有機(jī)介質(zhì)，如正己烷或正庚烷溶劑下催化合成[11]，而酶催化己酸和無(wú)水乙醇合成己酸乙酯的無(wú)溶劑體系，產(chǎn)品后期處理更簡(jiǎn)單，環(huán)境污染較小，但因?yàn)榉磻?yīng)體系的極性較高，易造成酶蛋白變性而降低催化活性，所以現(xiàn)在對(duì)無(wú)溶劑體系酶催化合成己酸乙酯的研究相對(duì)較少[12]。本研究擬通過(guò)固定化、吸水劑和中和試劑的調(diào)節(jié)作用，穩(wěn)定黑曲霉脂肪酶（Aspergillusniger Lipase,ANL）的催化活性，提高無(wú)溶劑體系酶催化合成己酸乙酯的效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：黑曲霉脂肪酶ANL購(gòu)于杭州創(chuàng)科生物科技有限公司（12000 U/g），羧甲基纖維素（CMC）由施瑞客（天津）生物技術(shù)有限公司提供，正己酸、無(wú)水乙醇和無(wú)機(jī)鹽皆為分析純。

儀器：全溫振蕩器（HZQ-Q，哈爾濱）；氣相色譜儀(GC，Echrom A90，上海)，配有氫火焰檢測(cè)器和毛細(xì)管柱（SE-30 30m×0.32mm×0.33μm）。

1.2 ANL固定化

在10m L柱形玻璃瓶?jī)?nèi)，加10mg的ANL酶粉，再加0.2m L濃度為0.05%的CMC溶液（或0.2m L水），將其敞口固定在全溫振蕩器中，以37℃、160 r/m in保持7 h以上，至恒重，得固定于瓶?jī)?nèi)壁上的固定化酶CMC-ANL（或水-ANL）。

1.3 酶促反應(yīng)

向含有ANL酶粉、水-ANL或CMC-PCL的柱形玻璃瓶反應(yīng)器（3種酶制劑含ANL皆為10mg）中，加入0.6m L正己酸和3.5m L無(wú)水乙醇（mol:mol,1∶12.5），封口后固定在恒溫振蕩器中，以37℃、160 r/m in反應(yīng)。

1.4 調(diào)節(jié)反應(yīng)

向上述含有3種酶制劑和反應(yīng)液的3個(gè)反應(yīng)器中，分別加入10mg的無(wú)水Na2SO4或無(wú)水Na2SO4+無(wú)水Na2CO3（各10mg），然后封口并固定在恒溫?fù)u床中，以37℃、160 r/min保持24 h。

1.5 動(dòng)力學(xué)分析

取反應(yīng)液1μL，用1m L正己烷稀釋，經(jīng)0.25μL微孔濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行GC分析。進(jìn)樣口溫度280℃，壓力3 psi；柱程序：130℃保留5 m in，以80℃/m in升至280℃，保留6m in；檢測(cè)器溫度300℃。己酸和己酸乙酯的保留時(shí)間分別為：7.58m in和7.86m in。轉(zhuǎn)化率c(%)按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 ANL酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

圖1 酶促合成己酸乙酯

ANL酶催化己酸與無(wú)水乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成己酸乙酯，見(jiàn)圖1。為利于反應(yīng)向右進(jìn)行，乙醇使用過(guò)量。ANL酶粉、水-ANL和CMC-ANL催化合成乙酸己酯反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖2，它們轉(zhuǎn)化底物的能力由小到大的次序?yàn)锳NL酶粉＜水-ANL＜CMC-ANL。這是因?yàn)?，在有機(jī)體系中，酶蛋白容易變性[13]，因而ANL酶粉活性較低。固定化過(guò)程中，使用的水在一定程度上可以優(yōu)化酶蛋白，因而水-ANL的活性高于酶粉。固定化過(guò)程中，使用的CMC是一種多羥基大分子[14]，類似于水分子，可替代水在有機(jī)相中穩(wěn)定酶的構(gòu)象[15]，因而CMC-ANL活性更高。

圖2 3種ANL催化合成己酸乙酯反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率

2.2 無(wú)水Na2SO4對(duì)反應(yīng)平衡的拉動(dòng)

依據(jù)參考文獻(xiàn)[16]，ANL催化合成己酸乙酯的條件設(shè)為37℃和160 r/m in。因反應(yīng)有水生成（如圖1），向反應(yīng)體系中加入吸水劑，理應(yīng)拉動(dòng)反應(yīng)向右進(jìn)行。加入10mg無(wú)水Na2SO4后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率有明顯提高，ANL酶粉、水-ANL和CMC-ANL催化的反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化率分別提高到61.6%、74.4%和82.7%（表1）。相對(duì)于未加吸水劑之前，轉(zhuǎn)化率分別提高了7.4%、9.7%和10.2%。尤其是在CMC-ANL催化的反應(yīng)體系中，無(wú)水Na2SO4使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率明顯升高，約增加10.2%/10mg Na2SO4；而在硅膠作為吸水劑的正己烷溶劑體系中，經(jīng)計(jì)算，約增加1.2%/10mg硅膠[17]，前者是后者的8.3倍。在具體生產(chǎn)過(guò)程中，如果要進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率，可適當(dāng)再增加無(wú)水Na2SO4的用量。

表1 Na2SO4和Na2CO3對(duì)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 中和劑對(duì)酶催化作用的影響

ANL的最佳作用pH值為8[18]，因此與非極性溶劑體系相比較[17]，在極性較大的己酸和乙醇的混合液中，己酸能電離出質(zhì)子，不利于ANL發(fā)揮催化作用的。為此，研究設(shè)想用無(wú)水Na2CO3來(lái)中和反應(yīng)體系中的過(guò)多質(zhì)子。結(jié)果表明，在Na2SO4和Na2CO3共存時(shí)，能夠更有效地提高反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化率，使ANL酶粉、水-ANL和CMCANL催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率分別進(jìn)一步提高到72.3%、81.9%和91.0%（表1）。相對(duì)于未加無(wú)水Na2CO3的體系，轉(zhuǎn)化率又分別提高了10.6%、7.5%和8.3%。尤其是CMC-ANL催化的反應(yīng)體系，CMC、Na2SO4和Na2CO3共同作用的結(jié)果，使轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.0%（見(jiàn)圖3）。

圖3 Na2SO4和Na2CO3共存在時(shí)CMC-ANL催化反應(yīng)24 h的GC圖

3 結(jié)論

以0.2m L濃度為0.05%的CMC水溶液，溶解脂肪酶ANL，通過(guò)物理吸附法，將其固定在玻璃瓶壁上，制備出固定化酶CMC-ANL，與反應(yīng)器一起形成簡(jiǎn)易的固定化酶生物反應(yīng)器。在催化合成己酸乙酯的無(wú)溶劑體系過(guò)程中，CMC-ANL的非水相活性和穩(wěn)定性明顯增加。添加吸水劑無(wú)水Na2SO4可以拉動(dòng)反應(yīng)，使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率從72.5%上升到82.7%，添加中和劑無(wú)水Na2CO3，可以使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步上升到91.0%。

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Exp loring the Regulation of Synthesisof EthylCaproate Catalyzed by Aspergillusniger Lipase

ZHAN Meirong1,DING Junzhu1,CONG Fangdi1,2,XING Kezhi2,ZHOUWenli2and ZHANG Shulin2
(1.Departmentof Biopharmaceutics,College of Basic Science,Tianjin AgriculturalUniversity,Tianjin 300384; 2.Tianjin Key Lab ofAquatic Ecology and Aquaculture,Tianjin 300384,China)

To improve the catalysis of Aspergillus niger lipase(ANL)in the synthesis of ethyl caproate,lipasewas immobilized on the inner wallof column glassbottle by physical absorption to form a facile bioreactor and then used in the reaction of caproic acid w ith ethanol to synthesize ethyl caproate.In solvent-free system w ith caproic acid and ethanol in a ratio of 0.6∶3.5(V∶V),ANL dosagewas 0.24%of this reaction system to catalyze theesterification at37℃and 160 r/min.Itwas showed that,water employed in the immobilization couldmodify the catalysisof ANL and carboxymethyl cellulose(CMC)could give better help on ANL.During the course of catalysis,anhydrous sodium sulfate could absorbwaterand pull reaction equilibrium to enhance reaction conversion,and anhydrous sodium carbonate could neutralize caproic acid to further increase reaction conversion.After24 h,the reaction conversion achieved at91.0%.

ethylcaproate;lipase;immobilization;catalytic activity;nonaqueousphase

TS262.3；TS261.4；Q814

A

1001-9286（2016）12-0028-03

10.13746/j.njkj.2016270

天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(TJAE201502)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270456)。

2016-09-05

詹美榕（1993-），女，研究方向：食品添加劑的酶促合成。

叢方地。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-11-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161104.1415.004.htm l。