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    IPS細胞定向分化為造血干細胞關鍵技術的研究進展

    2016-12-22 17:47:31曾憲卓陳帥王一飛舒輝萍張捷滕嬌
    科學與財富 2016年18期
    關鍵詞:分化

    曾憲卓+陳帥+王一飛+舒輝萍+張捷+滕嬌+李德智+莫建華

    摘要:本文研究了誘導多能干細胞(IPS)分化為造血干細胞的能力。用小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9與人類IPS共培養(yǎng),將IPS分化為造血干細胞,用流式細胞術檢測造血干細胞表面標志物的表達水平,實時熒光定量檢測分化過程中IPS與造血干細胞的基因表達水平的變化,用免疫磁珠法分離CD34+造血干細胞檢測細胞的集落形成能力。結(jié)果顯示:IPS與OP9細胞共培養(yǎng)誘導造血分化第四天IPS發(fā)生了變化,分化得到造血干細胞的表面標志物CD34。分化過程中多能性標志基因Oct4表達下降,造血轉(zhuǎn)錄因子表達升高,CD34的表達量逐漸升高,集落培養(yǎng)14天后得到紅系集落、粒系集落、巨核系集落等。從而得到結(jié)論通過將IPS細胞與OP9細胞共培養(yǎng),可誘導IPS細胞分化為造血干細胞。

    關鍵詞:IPS細胞;分化;造血干細胞

    0 引言

    目前,臨床上普遍使用造血干細胞移植,用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進行骨髓移植,則需要進行人體的白細胞抗原配型,否則發(fā)生免疫排異會危及患者生命?,F(xiàn)有臍帶血庫儲存的造血干細胞免疫原性弱,但數(shù)量供不應求,使其在疾病中的臨床應用中受到限制。隨著誘導性多能干細胞(IPS)提取技術的出現(xiàn),使分化自身細胞變?yōu)榱爽F(xiàn)實,不但避免了倫理問題,解決了免疫排斥問題,造血干細胞的數(shù)量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報道如下:

    1 材料和方法

    1.1細胞株的來源

    小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9購于美國ATCC,誘導性多能干細胞IPS由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。

    1.2試劑和儀器

    小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9的培養(yǎng)基為α-MEM,內(nèi)含20%的胎牛血清,OP9細胞誘導干細胞分化培養(yǎng)基為α-MEM(15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠),CD34來自MACS公司??贵w為APS-TRA-1-85,半固體培養(yǎng)基購于SCT公司。流式細胞儀為美國AccuriC6型,定量PCR儀為CFX96型。

    1.3方法

    在六孔板中先鋪好1%的metrigel進行細胞培養(yǎng),每三天添加0.5mmol/L的EDTA,以保持對照組細胞的未分化狀態(tài),OP9用細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)時放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里,,每隔四天用胰酶消化傳代。細胞培養(yǎng)溫度為37℃,CO2濃度為0.5,濕度飽和。

    OP9細胞進行傳代培養(yǎng)4天后,將OP9的培養(yǎng)液換成誘導干細胞分化的培養(yǎng)液,將UC013細胞洗兩遍后,再對邊緣部位細胞進行消化,將細胞吸出后加入Dispace,再用槍頭吹吸混勻細胞后,將其轉(zhuǎn)移到加有分化培養(yǎng)液的細胞盤中搖勻,在與上述培養(yǎng)的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進行培養(yǎng),培養(yǎng)的第二天將培養(yǎng)液換為共培養(yǎng)液,第四天開始每隔一天半換一次培養(yǎng)液,第九天收樣品。

    免疫磁珠法分選CD34+細胞,將細胞用PBS洗兩遍,接著用胰蛋白酶進行消化,制備單細胞懸液,再將細胞收集到離心管中進行離心,收集沉淀,再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后,向其中加入FCR和 CD34標記細胞,30秒后加入流式細胞緩沖液,再離心,然后吸取上清,加入流式細胞緩沖液重懸。將制備好的細胞懸液加入流式細胞儀進行分離,通過流式細胞儀分離柱的CD34-細胞被移出分離柱棄之,最終,通過加壓洗脫分離柱上黏附的細胞,即得到CD34+細胞。

    用流式細胞術進行檢測,將共培養(yǎng)9天后的細胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后,制備單細胞懸液,收集到離心管中,靜置五秒后,用加有2%血清的流式緩沖液重懸,細胞過濾后,加入FCR和抗體,孵育15min,再用流式緩沖液清洗,重懸,最后用流式細胞儀進行檢測。

    集落形成實驗。將分選的CD34+細胞接種到半固體培養(yǎng)基中,放于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng),每孔接種1萬個細胞,培養(yǎng)14-16天。然后,在顯微鏡下根據(jù)集落成的血細胞形成特征,對集落細胞進行分類和計數(shù)。同時,提取共培養(yǎng)2、4、6、8、10和12天的細胞的RNA,用RT-PCR法檢測各基因在細胞中的相對表達量。

    2 結(jié)果

    2.1細胞培養(yǎng)與觀察

    觀察培養(yǎng)的細胞,結(jié)果顯示,對照組未分化的人體細胞集落狀生長,呈扁平狀,排列緊密,沒有分化的跡象。實驗組培養(yǎng)2天后的細胞,表面布滿細胞集落,已進行造血干細胞分化。OP9細胞貼著細胞壁生長,細胞為三角形,周圍向外出伸出像纖維狀的偽足,細胞排列規(guī)則,生長迅速,培養(yǎng)4天后細胞鋪滿了培養(yǎng)皿底。

    2.2誘導造血干細胞分化

    通過在本實驗組的誘導分化條件下,對實驗組和對照組細胞的培養(yǎng),實驗組細胞分化到一定程度后,便開始大量克隆,細胞的形態(tài)也發(fā)生了分化,接著,OP9細胞開始出現(xiàn)老化跡象。

    2.3流式細胞術檢測

    共培養(yǎng)9天后用流式細胞儀檢測細胞造血表面標志物表達情況,用流式細胞儀分析培養(yǎng)細胞的CD34、CD43、CD31的表達情況,結(jié)果顯示表達上述表面標志物的細胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

    2.4 4RT-PCR檢測

    運用RT-PCR對共培養(yǎng)的細胞進行基因表達檢測,結(jié)果顯示,IPS細胞發(fā)生造血分化時,Oct-4基因的表達慢慢消失;造血轉(zhuǎn)錄因子基因表達緩慢升高;Runx-1基因在造血干細胞分化12天當中的表達呈波浪式變化,其中分化第二天表達量最高,第四天開始下降,第八天開始升高;CD34在造血分化過程中的基因表達量逐漸增高。

    2.5 CD34+細胞集落實驗

    CD34+細胞在半固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),根據(jù)造血干細胞的形態(tài)特征,對細胞集落進行分類和計數(shù)。結(jié)果顯示,紅系集落(CFU-E)、粒系集落(CFU-G)、巨核系集落(CFU-M)、?!藓讼导洌–FU-GM)集落數(shù)量持續(xù)升高,混合系集落(CFU-GEMM)的集落數(shù)量逐漸降至最低。

    3 討論

    隨著干細胞技術的發(fā)展,通過誘導分化得到造血干細胞已經(jīng)成為事實。相對于多能干細胞而言,IPS通過導入轉(zhuǎn)錄因子以及重編程進行定向分化的比例較低,,但是IPS的獲得方法比較簡單穩(wěn)定,避免了胚胎干細胞面臨的倫理和法律等問題,使IPS可以應用于細胞替代性治療,并可以進行疾病的機理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細胞分化得到的造血干細胞免疫原性較低,解決了移植排斥的問題。

    在本文的研究中,沒有外加細胞因子,直接將IPS細胞誘導分化為造血干細胞,結(jié)果獲得了20%的CD34+細胞,即造血干細胞,CD34是表達于造血干細胞的表面標志物,表明IPS可以分化為造血干細胞,但是轉(zhuǎn)化率比較低。Runx1是調(diào)控造血干細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子,期基因的表達量在分化過程中呈現(xiàn)波浪式的變化,Gata-2的表達則逐漸升高。體外分化得到的造血干細胞在半固體培養(yǎng)基中成集落狀態(tài),說明IPS可以向各細胞系進行分化。

    現(xiàn)在多能干細胞分化為造血干細胞的方法主要有:一是形成胚狀體后再進行誘導生成造血干細胞;二是基質(zhì)細胞與多能干細胞共培養(yǎng);三是形成EB后與OP9進行共培養(yǎng);四是單層誘導ESC生成造血干細胞。利用OP9細胞與胚胎干細胞共培養(yǎng),可以模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境,為研究細胞定向分化為造血干細胞創(chuàng)造了可能性,OP9細胞主要支持早期的造血干細胞分化,并協(xié)助B淋巴細胞增殖?;|(zhì)細胞通過釋放的細胞因子支持造血干細胞的分化。這種誘導方法分化時間短,為臨床造血干細胞的移植提供了便利。誘導分化過程中不用添加細胞因子,比較經(jīng)濟。但該誘導方法也存在著一定的缺點,即存在鼠源性污染細胞的可能性,加之所用血清的成分的不明確性,限制了其在臨床應用。

    目前臨床上移植造血干細胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細胞,而體外分化和擴增得到造血干細胞只能通過動物試驗來獲得。將造血干細胞植入重建小鼠體內(nèi),可以評價造血干細胞的功能。體外分化獲得的造血干細胞和臍血中的造血干細胞與重建小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)差異較大,需要進一步優(yōu)化體外誘導多能干細胞分化為造血干細胞的過程,才能滿足該實驗需求

    4 小結(jié)

    通過將IPS定向分化為造血干細胞的研究,成功誘導了造血干細胞,分化得到的細胞在體外培養(yǎng)中形成了所需的各系集落,本文的研究所采用的技術方法希望可以為IPS細胞在造血疾病中的應用提供一定的實驗依據(jù)。

    參考文獻:

    [1]張坤等.體外誘導人類誘導性多能干細胞分化為造血干/祖細胞的研究,中國實驗血液雜志,2014.01.

    [2]章忠明.自體造血干細胞移植治療B細胞非霍奇金淋巴瘤的研究進展,實用腫瘤雜志,2013.04.

    [3]楊晟.凋亡通路分子標志在T細胞淋巴瘤中的遺傳變異和蛋白表達,中國協(xié)和醫(yī)院大學,2007.

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