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    簡(jiǎn)單靈敏的GO-RRS-ET法測(cè)定氨基酸

    2016-12-22 02:47:51黎小椿李燕唐小閑羅楊合何星存
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2016年24期
    關(guān)鍵詞:茚三酮藍(lán)紫色馬蹄

    黎小椿,李燕,唐小閑,羅楊合,*,何星存

    (1.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院,廣西賀州542899;2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連116034)

    簡(jiǎn)單靈敏的GO-RRS-ET法測(cè)定氨基酸

    黎小椿1,2,李燕2,唐小閑1,2,羅楊合1,2,*,何星存1,2

    (1.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院,廣西賀州542899;2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連116034)

    在pH 7.2KH2PO4-NaOH緩沖液和85℃水浴加熱的條件下,氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色的產(chǎn)物羅曼紫(RP),使氧化石墨烯(GO)在400 nm處產(chǎn)生的RRS峰強(qiáng)度降低,這是由于作為供體的GO與作為受體的RP之間發(fā)生了RRS能量轉(zhuǎn)移(RRS-ET)所致。隨著氨基酸濃度增加,生成的RP增加,RRS-ET增強(qiáng),400 nm處RRS峰強(qiáng)度線性降低,其降低值在1.33μmol/L~200μmol/L氨基酸濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,據(jù)此建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、選擇性高的測(cè)定痕量氨基酸的RRS-ET新方法,檢測(cè)限1.0μmol/L。該方法用于馬蹄中氨基酸的檢測(cè),測(cè)得馬蹄果肉氨基酸含量為2.847mg/g,馬蹄皮氨基酸含量為1.094mg/g,可為馬蹄深加工提高有益參考。

    氧化石墨烯;共振瑞利散射;能量轉(zhuǎn)移;茚三酮;氨基酸

    自然界中的氨基酸有二十幾種,存在于大多數(shù)食品和糧食中。氨基酸的分析檢測(cè)對(duì)食品質(zhì)量監(jiān)控、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、疾病診斷和治療等具有重要意義,比如測(cè)定羥脯氨酸含量可鑒別牛奶是否為皮革水解蛋白“皮革奶”。當(dāng)前,利用分子光譜分析氨基酸的主要方法包括分光光度法、熒光法、共振瑞利散射(RRS)法、表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)法、化學(xué)發(fā)光法等,其中,RRS法是一種簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的光譜分析方法,已用于痕量金屬、非金屬、小分子藥物、蛋白質(zhì)、核酸等分析[1-3]。當(dāng)RRS光譜較強(qiáng)能量較高的物質(zhì)與RRS光譜較弱能量較低的物質(zhì)接觸時(shí),若前者的RRS光譜與后者的吸收光譜有重疊,兩者就會(huì)發(fā)生共振瑞利散射能量轉(zhuǎn)移(RRS-ET),導(dǎo)致前者RRS光譜減弱,由此建立的RRS-ET新方法已實(shí)現(xiàn)了對(duì)痕量茶多酚、碘酸根、過(guò)氧化氫等物質(zhì)的檢測(cè)[4-5]。

    氧化石墨烯(GO)是石墨烯的重要衍生物,具有較強(qiáng)的RRS光譜,它不但價(jià)格低廉,原料易得,而且具有單層石墨平面結(jié)構(gòu),含有豐富的含氧活性基團(tuán),如羥基、羧基、環(huán)氧基,易溶于水,其特殊的結(jié)構(gòu)使其具有高效的吸附性、兩親性、熒光猝滅性和拉曼散射性,已被廣泛用于生化分析[6],但鮮見(jiàn)基于GO的RRSET測(cè)定痕量氨基酸的研究報(bào)道。氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成的藍(lán)紫色化合物羅曼紫(RP)的RRS光譜較弱,吸收光譜與GO的RRS光譜有一定的重疊。本文利用GO與RP之間發(fā)生RRS-ET導(dǎo)致GO的RRS減弱,建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、選擇性高的測(cè)定痕量氨基酸的新方法,并用于馬蹄中氨基酸含量的檢測(cè),結(jié)果令人滿意。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器和試劑

    F-7000型熒光分光光度計(jì):日立公司;TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FEIQuanta 200 FEG場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡:荷蘭飛利浦公司;納米粒度和Zeta電位儀:英國(guó)馬爾文儀器有限公司;SK 1200H超聲波反應(yīng)器:上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

    50mmol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBS):上海鵬彩精細(xì)化工有限公司;20 g/L茚三酮溶液:上海國(guó)藥集團(tuán);1mmol/L甘氨酸(Gly):石家莊東華金龍化工有限公司。

    0.1 g/L氧化石墨烯(GO,南京先豐納米材料科技有限公司):準(zhǔn)確稱量0.1000 g GO,加水超聲溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶,定容至100mL,得到1 g/LGO,使用時(shí)以水稀釋10倍得到0.1 g/LGO,使用前超聲15min。

    試驗(yàn)所用試劑均為分析純級(jí)試劑,試驗(yàn)所用水均為亞沸水。

    1.2 方法

    在試管中依次加入90μLpH 7.2PBS、70μL 20 g/L的茚三酮溶液,分別加入一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、天門冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)],85℃水浴加熱10min,流水冷卻后,加入400μL 0.1 g/LGO,用亞沸水定容到1.5mL。在電壓450 v、激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm、發(fā)射濾波器為1%T衰減器、λex-λem=Δλ=0的條件下,用熒光分光光度計(jì)同步掃描獲得共振瑞利散射(RRS)光譜。測(cè)量溶液的RRS強(qiáng)度I,以不加氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液做試劑空白的RRS值為I0,計(jì)算ΔI400nm=I0-I值。

    7.2.2梨小食心蟲(chóng)①誘殺越冬幼蟲(chóng)。4月中旬開(kāi)始在樹(shù)干上綁誘蟲(chóng)帶,誘殺越冬幼蟲(chóng)。②誘捕成蛾。梨小食心蟲(chóng)具趨味性,4月至采摘結(jié)束在果園里用廣口瓶裝糖醋液或者幼蟲(chóng)凈誘捕成蟲(chóng)。③噴藥防治。第1代在4月上旬防治,9月份集中防治第4代害蟲(chóng),用藥與桃小食心蟲(chóng)相同。④果實(shí)套袋,也能避免危害。梨小食心蟲(chóng)在貴州長(zhǎng)順縣蘋果園的最佳防治措施是從4月中旬開(kāi)始,每畝果園用30~35套迷向管進(jìn)行迷向防治,每40~50天更換1次迷向劑,直至蘋果采摘結(jié)束。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 方法原理

    非金屬納米材料GO具有較強(qiáng)的RRS效應(yīng)。在pH 7.2PBS和水浴加熱的條件下,氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色的配合物羅曼紫(RP),其RRS光譜較弱,能量較低,其吸收光譜與GO的RRS光譜有一定的重疊。當(dāng)兩者接近時(shí),GO將RRS能量轉(zhuǎn)移給RP,導(dǎo)致體系的RRS強(qiáng)度降低。隨著氨基酸濃度增加,生成的RP增多,GO轉(zhuǎn)移給RP的RRS能量也隨之增多,體系400 nm處的RRS強(qiáng)度線性降低(圖1)。據(jù)此可建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、選擇性高的測(cè)定痕量氨基酸的RRS-ET新方法。

    圖1 氧化石墨烯-氨基酸-茚三酮體系RRS-ET原理圖Fig.1 RRS-ET principleof grapheneOxide-am ino acidsninhydrin system

    2.2 RRS光譜

    Gly-茚三酮-GO體系的RRS光譜如圖2所示。

    圖2 G ly-茚三酮-GO體系的RRS光譜Fig.2 RRSspectra of theG ly-ninhydrin-GO system

    GO具有較強(qiáng)的RRS效應(yīng),當(dāng)體系中加入pH 7.2 PBS和茚三酮時(shí),其RRS光譜無(wú)明顯變化。在pH 7.2PBS和85℃水浴加熱條件下,以甘氨酸(Gly)為代表的氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物羅曼紫(RP),其RRS光譜極弱。當(dāng)GO與RP共存時(shí),體系的RRS光譜強(qiáng)度隨著氨基酸濃度的增加而減弱,其中400 nm處RRS減弱最多,并出現(xiàn)了一個(gè)峰谷,故本文選擇GO體系400 nm RRS峰降低值測(cè)量痕量氨基酸含量。

    2.3 吸收光譜

    在pH 7.6 PBS中,茚三酮的吸收光譜很弱,在350 nm~700 nm沒(méi)有吸收峰;甘氨酸與茚三酮反應(yīng)生成的藍(lán)紫色產(chǎn)物羅曼紫在400、565 nm處有2個(gè)強(qiáng)度相當(dāng)?shù)奈辗澹译S著甘氨酸濃度增大,體系的吸收光譜增強(qiáng)。GO的吸收光譜較弱,當(dāng)體系中加入pH 7.2 PBS和茚三酮時(shí),亦無(wú)明顯變化。當(dāng)GO與甘氨酸(Gly)跟茚三酮反應(yīng)生成的藍(lán)紫色化合物羅曼紫(RP)共存時(shí),體系原來(lái)強(qiáng)度相當(dāng)?shù)?00 nm吸收峰便強(qiáng)于565 nm吸收峰(圖3)。這證明了GO與RP之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移,是導(dǎo)致GO的RRS光譜強(qiáng)度減弱且400 nm處減弱最多的原因。

    圖3 Gly-茚三酮-GO體系的吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of the G ly-ninhydrin-GO system

    2.4 SEM圖

    由圖4(a)和圖4(b)可知,GO的粒徑在加入Glu前后未發(fā)生改變,說(shuō)明體系RRS光譜強(qiáng)度減弱不是由于體系中納米粒子粒徑的改變引起的,而是由于發(fā)生了RRS-ET。

    2.5 分析條件的優(yōu)化

    圖4 氧化石墨烯的SEM圖Fig.4 SEM im agesof GO

    以Glu為代表優(yōu)化了GO-RP體系RRS-ET法測(cè)定氨基酸的條件。考察了PBS的pH和濃度、茚三酮溶液濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間、GO濃度對(duì)RRS光譜的影響。結(jié)果表明,當(dāng)PBS的pH為7.2、濃度為3mmol/L,茚三酮溶液濃度為0.93 g/L,反應(yīng)溫度為85℃、時(shí)間10 min,GO濃度為26.7 mg/L,ΔI400nm=I0-I值達(dá)到最大。

    2.6 工作曲線

    在3 mmol/L pH 7.2 PBS、0.93 g/L茚三酮溶液、85℃水浴加熱10min、26.7mg/LGO的最優(yōu)條件下,按試驗(yàn)方法繪制了甘氨酸(Gly)的RRS工作曲線(圖5),回歸方程ΔI400nm=4.72C+12,R2=0.995 8,Gly濃度線性范圍1.33μmol/L~200μmol/L,檢測(cè)限1.0μmol/L。

    圖5 G ly-茚三酮-GO的RRS工作曲線Fig.5 RRSworking cureof theG ly-ninhydrin-GO system

    2.7 共存物質(zhì)的影響

    按試驗(yàn)方法考察了測(cè)定3.33μmol/LGly時(shí)其它共存物質(zhì)的干擾情況,結(jié)果表明,在相對(duì)誤差不超過(guò)± 10.0%的范圍內(nèi),10 000倍的尿素、NO2-、NO3-,500倍的Cl-、Br-、S2-、SO32-、Pb2+和100倍的Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、SO42-等常見(jiàn)物質(zhì)不干擾測(cè)定。對(duì)于含有氨基可以與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物羅曼紫的多肽、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì),可以通過(guò)簡(jiǎn)單的沉淀分離方法除去。因此,本方法具有較好的選擇性。

    2.8 樣品分析

    將從市場(chǎng)采購(gòu)的馬蹄洗凈,分開(kāi)馬蹄果皮和果肉。稱取29.785 0 g馬蹄皮于燒杯中,加150mL沸水煮沸15min,抽濾后將濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶,定容至250mL。稱取68.850 1 g馬蹄果肉,用研缽研碎后轉(zhuǎn)移至燒杯中,加150mL沸水煮沸15min,抽濾后將濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶,定容至250mL。取適量的馬蹄皮和馬蹄果肉提取液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 樣品分析結(jié)果(n=5)Table2 Results for detection of samples

    由表2可知:1)馬蹄果肉氨基酸含量為2.847mg/g,馬蹄皮氨基酸含量為1.094mg/g;2)該方法回收率在91.7%~101%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.7%~4.2%之間,說(shuō)明靈敏度較高。

    3 結(jié)論

    本文利用氨基酸與茚三酮在85℃水浴加熱條件下反應(yīng)生成的藍(lán)紫色物質(zhì)羅曼紫,與非金屬納米材料氧化石墨烯發(fā)生共振瑞利散射能量轉(zhuǎn)移(RRS-ET),導(dǎo)致體系400 nm處的共振瑞利散射強(qiáng)度隨著氨基酸濃度的增大而線性減弱,據(jù)此建立了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、選擇性高的測(cè)定痕量氨基酸的RRS-ET新方法,氨基酸濃度線性范圍1.33μmol/L~200μmol/L,檢測(cè)限1.0μmol/L。該方法用于馬蹄中氨基酸含量的檢測(cè),測(cè)得馬蹄果肉氨基酸含量為2.847mg/g,馬蹄皮氨基酸含量為1.094mg/g,可為馬蹄深加工提高有益參考。

    [1]LUOYH,ZHANGX H,YAODM,etal.Resonance Rayleigh scattering detection of trace PDGF based on catalysis of an aptamermodified nanogold probe in the Fehling reaction[J].RSCAdvances, 2014,4(53):28052-28055

    [2]LUOY H,XU L L,LIANGAH,etal.A highly sensitive resonance Rayleigh scattering assay for detection of Hg (II)using immunonanogold as probe[J].RSC Advances,2014,4(37):19234-19237

    [3] LUO Y H,WANG P F,LIT S,et al.A highly sensitive enzyme catalytic method for the detection of ethanol based on resonance scattering effect of gold particles[J].Plasmonics,2013,8(2):307-312

    [4]LIANG A H,WANG Y H,WENG Q,et al.A silver nanorod resonance rayleigh scattering-energy transfer analytical platform for trace tea polyphenols[J].Food Chemistry,2016,197(Part A):395-399

    [5]WANG Y H,ZHANG X H,LIU Q Y,et al.A simple and sensitive graphene oxide/gold nanoparticle surface plasmon resonance Rayleigh scattering-energy transfer analyticalplatform for detection of iodideand H2O2[J].RSCAdvances,2015,5(12):9272-9277

    [6]LIU ZB,LIUBW,DING JS,etal.Fluorescentsensorsusing DNA-functionalizedgrapheneoxide[J].Analyticaland BioanalyticalChemistry,2014,406(27):6885-6902

    A Sim ple and Sensitive Graphene Oxide Resonance Rayleigh Scattering-energy Transfer M ethod for Detection of Am ino Acids

    LIXiao-chun1,2,LIYan2,TANGXiao-xian1,2,LUOYang-he1,2,*,HEXing-cun1,2
    (1.Institute of Food Scienceand Technology,Hezhou University,Hezhou 542899,Guangxi,China;2.School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,Liaoning,China)

    Nonmetallic nanomaterialgraphene oxide(GO)hasstrong RRSeffect thatexhibited a strong RRS peak at400 nm.In the presence ofpH 7.2 KH2PO4-NaOH buffer solution and 85℃water bath heating,ninhydrin reacted with aminoacids to form blue-violetcomplex Ruhemann'spurple(RP)that reduced the RRSpeak at400 nm due to the RRS-energy transfer(RRS-ET)from the GO as donors to the RPas receptors.With the increase of amino acids concentration,the formed RP increased,and the RRS intensity quenched linearly at 400 nm due to the RRS-ETenhancing.The quenched intensity responds linearlywith amino acids concentration in the range of 1.33μmol/L-200μmol/L.Thus,a new RRS-ETmethod for the determination of trace amino acidswasestablished with the detection limitof1.0μmol/L.Themethod used in the detection ofamino acids in water chestnut,and the amino acid contentof the peeland fleshwere 2.847mg/g and 1.094mg/g respectively.It could bea useful reference for the processing ofwater chestnut.

    grapheneoxide;ResonanceRayleigh Scattering;energy transfer;ninhydrin;aminoacids

    10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.023

    2016-04-19

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21365011;21367012)

    黎小椿(1987—),女(漢),在讀碩士研究生,研究方向:食品分析。

    *通信作者:羅楊合(1969—),男(漢),教授,博士,研究方向:食品分析。

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