馬鈴薯晚疫病菌交配型檢測方法比較

繆云琴，孟然然，唐 唯，楊 仙，李燦輝

(云南師范大學(xué)薯類作物研究所, 云南 昆明 650500)

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馬鈴薯晚疫病菌交配型檢測方法比較

繆云琴，孟然然，唐 唯，楊 仙，李燦輝*

(云南師范大學(xué)薯類作物研究所, 云南 昆明 650500)

晚疫病是云南省馬鈴薯第一大病害，近年在云南省種植區(qū)有逐年加重的趨勢，從1998年發(fā)現(xiàn)晚疫病菌的2種交配型以來，有性生殖的風(fēng)險也隨之增加。文章以2010年來自云南省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的86個晚疫病菌菌株為材料，以對峙培養(yǎng)檢測法檢測結(jié)果為準(zhǔn)，比較分析了CAPs標(biāo)記和A2特異性DNA片段擴(kuò)增方法的準(zhǔn)確性。研究證實了2種分子標(biāo)記檢測方法均可以準(zhǔn)確檢測出晚疫病菌A1和A2交配型，但不能區(qū)分A2和A1A2交配型。A2交配型占總菌株的82.56 %，在云南省所有馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)都存在，已成為云南省晚疫病菌群體中的優(yōu)勢交配類型。

晚疫病菌；交配型；對峙培養(yǎng)；分子標(biāo)記檢測

馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)屬異宗配合卵菌，存在A1和A2兩種交配型。A2交配型最早在墨西哥發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代后，迅速傳播至全球幾乎所有馬鈴薯生產(chǎn)國家[1-3]。1996年，中國首次報道發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌A2交配型[4]。不同交配型菌株并存，意味著晚疫病菌群體有可能進(jìn)行有性生殖。有性生殖不僅可產(chǎn)生致病性和適應(yīng)性更強(qiáng)的后代群體；產(chǎn)生的卵孢子還可成為新的侵染源，導(dǎo)致晚疫病發(fā)生和流行規(guī)律出現(xiàn)新的變化，進(jìn)一步嚴(yán)重威脅全球馬鈴薯的生產(chǎn)[5]。為此，有關(guān)A2交配型菌株的傳播及其對馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)的影響等研究，引起了國內(nèi)外的極大關(guān)注。

由于獨特的自然地理環(huán)境和氣候條件，云南省一年四季均有馬鈴薯大面積種植，晚疫病周年發(fā)生。1998年，云南省發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌A2交配型[6]。此后報道表明，A2交配型菌株僅局限于個別地方發(fā)現(xiàn)，且出現(xiàn)的頻率極低；但同期云南省馬鈴薯晚疫病菌群體的多樣性卻較高[7]。近年來，隨著種薯的大規(guī)模調(diào)運，病原菌傳播速度加快，馬鈴薯晚疫病流行所造成的危害明顯增加。所以，及時監(jiān)測馬鈴薯晚疫病菌群體的結(jié)構(gòu)變化，尤其A2交配型的出現(xiàn)和傳播，對該流行性病害綜合治理具有重要的價值。

迄今，國內(nèi)外通常采用對峙培養(yǎng)方法檢測馬鈴薯晚疫病菌的交配型[1-7]。但該方法耗時費力，不便于對快速演化的晚疫病菌群體進(jìn)行及時的監(jiān)測。1995年，Judelson等報道了一些與晚疫病菌交配型決定位點緊密連鎖的分子標(biāo)記[8-9]。2002年，Kim和Lee利用AFLP方法，開發(fā)出可特異性檢測A2交配型的DNA分子標(biāo)記[10]。國外已有報道表明，Judelson報道的CAPs標(biāo)記可準(zhǔn)確檢測A1和A2交配型[11-12]。為此，本實驗利用多樣性較豐富的云南省馬鈴薯晚疫病菌群體樣本，對交配型分子標(biāo)記檢測和傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)檢測方法進(jìn)行了比較，意在尋找快速有效的晚疫病菌交配型監(jiān)測方法。

1 材料與方法

1.1 晚疫病菌的采集與分離純化

1.1.1 晚疫病菌的采集 2010年2-10月，從云南省不同生產(chǎn)季節(jié)的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集主栽品種(合作88，會-2)的晚疫病樣本，分別用保鮮袋帶回實驗室。

1.1.2 晚疫病菌的分離純化 參照Cornell大學(xué)方法[13]，在培養(yǎng)皿底部鋪雙層吸水紙，用適量蒸餾水浸濕，將帶單個病斑的葉片正面向上放在吸水紙上，用保鮮膜覆蓋培養(yǎng)皿以保持皿內(nèi)的相對濕度，室內(nèi)散射光條件下(15～23 ℃)誘發(fā)培養(yǎng)1～3 d。待病斑周圍有菌絲生長時，在超凈工作臺上挑取少量菌絲體接種到選擇培養(yǎng)基中，于17～18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4～5 d。待有純凈菌絲長出后，沿著菌落邊緣小心挑取少量菌絲，接種在新配制的選擇培養(yǎng)基或黑麥瓊脂培養(yǎng)基A上分離培養(yǎng)；根據(jù)分離培養(yǎng)菌落的形態(tài)特征，進(jìn)一步進(jìn)行單孢或單菌絲分離純化培養(yǎng)。將純化后的菌株轉(zhuǎn)接至黑麥瓊脂培養(yǎng)基B上保存；2010年共分離純化獲得86個馬鈴薯晚疫病菌(表2)。

1.2 晚疫病菌交配型檢測

1.2.1 對峙培養(yǎng)檢測方法 將待測菌株和已知交配型的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種至黑麥-V8蔬菜汁(10 %)瓊脂培養(yǎng)基上，在17～18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10～15 d。然后，分別取待測菌株和A1交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株(80029)或A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株(88133)的菌塊，以3 cm的間距轉(zhuǎn)接到直徑為9 cm的對峙培養(yǎng)皿中，在17～18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)約15 d。觀察對峙培養(yǎng)菌株的生長情況，并在2個菌落交融處的培養(yǎng)基表面取樣，制作簡易封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察是否有卵孢子形成(圖1)。

在對峙培養(yǎng)中，若待測菌株僅與A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株對峙產(chǎn)生卵孢子，則待測菌株為A1交配型；反之，若其僅與A1交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株對峙產(chǎn)生卵孢子，則為A2交配型；若待測菌株分別與A1和A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株對峙培養(yǎng)都有卵孢子產(chǎn)生，但繼代繁殖和保存培養(yǎng)期間未發(fā)現(xiàn)自發(fā)卵孢子形成，則將其定義為A1A2型；若待測菌株本身就能產(chǎn)生卵孢子，則定義為自育(Self-fertile)型。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測方法 按照Mazakova等報道的方法提取馬鈴薯晚疫病菌基因組DNA[12]。分別采用Judelson等[8]開發(fā)的CAPs標(biāo)記方法和Kim和Lee[10]報道的A2交配型特異性DNA片段擴(kuò)增方法檢測待測菌株的交配類型。所用引物序列和擴(kuò)增目的片段等見表1。

CAPs標(biāo)記檢測：①PCR反應(yīng)體系：4 ng的模板DNA，5 μl MgCl2(25 mM)，5 μl的10×Buffer，2 μl dNTPs (2.5 mM each)，各2 μl的正向和反向引物(10 μM)，0.4 μl的Taq酶(5 U/μl)，加ddH2O至終體積50 μl。擴(kuò)增條件為95 ℃ 3 min，(95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 cycles)，72 ℃ 5min。②PCR產(chǎn)物酶切：取5 μl PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果后，取10 μl PCR產(chǎn)物中加入1UBsuRⅠ酶，10×Buffer 2 μl ，100×BSA 0.2μl，補(bǔ)ddH2O至終體積20μl，37 ℃酶切4 h后，95 ℃滅活處理10 min。用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，存在457 bp+100 bp條帶的為A2交配型；既有457 bp+100 bp條帶，又有557 bp條帶的為A1交配型(圖2)。

A2交配型特異性DNA標(biāo)記檢測：①PCR反應(yīng)體系：4 ng的模板DNA，4 μl MgCl2(25 mM)，5 μl的10×Buffer，1 μl dNTPs (2.5 mM each)，各1 μl的正向和反向引物(10 μM)，0.4 μl的Taq酶(5U/μl)，加ddH2O至終體積50 μl。35個循環(huán)，退火溫度為60 ℃，其余擴(kuò)增條件同CAPs。②瓊脂糖凝膠電泳檢測：模板DNA經(jīng)引物PHYB-1和PHYB-2擴(kuò)增后，取5 μl PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 分子標(biāo)記檢測方法信息

圖1 待測菌株交配型對峙培養(yǎng)檢測Fig.1 Pairing culture method for mating type detection

2 結(jié)果與分析

2.1 對峙培養(yǎng)檢測

利用傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)，云南省不同季節(jié)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的晚疫病菌群體中存在A1、A2和A1A2 計3種交配型(圖1，表2)。其中，A2交配型菌株比率達(dá)所測菌株總數(shù)的82.56 %，所有采樣地點均已發(fā)現(xiàn)；同時，在曲靖、昆明、大理和麗江市的春作馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)還檢測到一定比率的A1A2交配型菌株，而之前，在全省范圍內(nèi)占絕對優(yōu)勢的A1交配型則僅在個別地點檢測到[7,14]。此結(jié)果表明，云南省馬鈴薯晚疫病菌群體的交配類型已經(jīng)從A1交配型為主體，突然轉(zhuǎn)變?yōu)橐訟2交配型菌株占優(yōu)勢的特殊狀態(tài)。盡管馬鈴薯晚疫病菌交配類型的這種突然轉(zhuǎn)變，在英國、荷蘭、比利時、法國和北愛爾蘭等國家也曾出現(xiàn)過[15]；但是，迄今尚不清楚導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因，以及A1A2交配型菌株在其中所起的作用。

2.2 分子標(biāo)記檢測

為了驗證上述檢測結(jié)果，本研究進(jìn)一步利用Judelson等開發(fā)的與晚疫病菌交配型決定位點緊密連鎖的CAPs標(biāo)記[8]，及Kim和Lee報道的A2交配型特異性DNA標(biāo)記[10]，對所有待測菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的交配類型進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測。

根據(jù)CAPs標(biāo)記檢測方法，可以清楚地將所有供試菌株區(qū)分為A1或A2交配型。僅出現(xiàn)457 bp+100 bp條帶的菌株為A2交配型，而同時存在457 bp+100 bp和557 bp條帶的菌株則為A1交配型[8, 11](圖2)。該標(biāo)記檢測結(jié)果與對峙培養(yǎng)中A1和A2交配型的檢測結(jié)果相吻合；但是，對峙培養(yǎng)檢測為A1A2交配型的菌株，CAPs標(biāo)記檢測結(jié)果卻均為A2交配型(表2)。Judelson基于與晚疫病菌交配型決定位點緊密連鎖的其它位點標(biāo)記檢測，也曾報道無法準(zhǔn)確區(qū)分A2和A1A2交配型(和/或)自育型的結(jié)果[9]；由此推測，A1交配型決定位點可能屬于雜合位點 (Aa)，A2交配型可能為純合 (aa)，而A1A2或自育型菌株則可能與三體 (Trisomy, Aaa)的出現(xiàn)或染色體重排有關(guān)[9, 16]。

根據(jù)A2交配型特異性DNA標(biāo)記檢測方法，也可清楚地將所有供試菌株區(qū)分為A1或A2交配型。對峙培養(yǎng)檢測為A2和A1A2交配型的菌株中，均可以擴(kuò)增到分子量為347 bp條帶；而A1交配型菌株中，則不存在此擴(kuò)增產(chǎn)物[10](圖3)。所以，此標(biāo)記檢測結(jié)果與CAPs標(biāo)記結(jié)果相同，即不能區(qū)分對峙培養(yǎng)檢測為A2和A1A2交配型的菌株(表2)。但是，如果認(rèn)為交配型由同一位點的1對等位基因決定，且A1、A2和A1A2或自育型的推測基因型分別為Aa、aa和Aaa[9, 16]，則表明A2交配型特異性DNA標(biāo)記和CAPs標(biāo)記法所檢測的位點不同，或交配型決定位點或緊密連鎖區(qū)域存在較大片段DNA的缺失。

M= MW 100bp ladder；A2-E= reference isolate 88133；A1-E= reference isolate 80029; Line 1 and 2 are isolates collected from Kunming; 3 and 4 from Dali; 5 and 6 from Lijiang; 7 and 8 from Chuxiong; 9 and 10 from Qujing; 11 from Yuxi; 12-13 from Dehong圖2 基于CAPs標(biāo)記(W16-1/16-2)的交配型檢測Fig.2 Results of mating type detection based on CAPs marker (W16-1/16-2) method

表2 馬鈴薯晚疫病菌交配型檢測結(jié)果比較

上述實驗結(jié)果表明，傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)方法可在待測菌株中檢測到A1、A2和A1A2 計3種交配型；結(jié)合待測菌株的自育型觀察，則可鑒別出已報道的4種交配型。而CAPs標(biāo)記和A2交配型特異性DNA標(biāo)記方法只能區(qū)分A1和A2交配型，無法區(qū)分A2和A1A2交配型。

3 討 論

對峙培養(yǎng)是檢測異宗配合晚疫病菌交配型的傳統(tǒng)方法，結(jié)果直觀可靠；但需要擁有已知交配類型的標(biāo)準(zhǔn)菌株和純化的待測菌株，而且，從待測菌株的分離純化到對峙培養(yǎng)檢測耗時較長，不便于對快速演化的晚疫病菌群體的交配類型進(jìn)行及時的監(jiān)測。為此，本研究利用2010年在云南分離純化的86個馬鈴薯晚疫病菌菌株，比較了2種國外報道認(rèn)為可信的交配型分子標(biāo)記檢測方法[ 8-12]。

實驗結(jié)果表明，與采用傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)方法比較，本文章采用的CAPs標(biāo)記和A2交配型特異性DNA標(biāo)記方法，可準(zhǔn)確檢測出A1和A2交配型，但無法區(qū)分A2和A1A2交配型。然而，鑒于2種分子標(biāo)記檢測的DNA位點不同，而結(jié)果卻一致；并與傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)方法的檢測結(jié)果相一致。所以，CAPs標(biāo)記和A2交配型特異性DNA標(biāo)記方法可以應(yīng)用于馬鈴薯晚疫病菌群體的交配型監(jiān)測。對于2種分子檢測方法得到結(jié)果一致，作者認(rèn)為云南省晚疫病菌群體，可用A2 特異性引物PHYB檢測代替CAPs，因為只需1次PCR，省去酶切過程，減少實驗可能帶來的誤差。本實驗室下一步將對自育型、A2和A1A2型的菌株進(jìn)行交配型檢測方法的比較及序列分析，期望尋找到一種和對峙培養(yǎng)完全吻合的分子檢測方法, 運用于大規(guī)模的晚疫病菌群體研究。

一般認(rèn)為，馬鈴薯晚疫病菌的交配型受1對等位基因決定: A1交配型可能屬于雜合基因型(Aa)，A2交配型可能為純合(aa)，而A1A2或自育型菌株則可能與三體(trisomy, Aaa)的出現(xiàn)或染色體重排有關(guān)[9, 16]。但是，綜合分析CAPs標(biāo)記和A2交配型特異性DNA標(biāo)記檢測結(jié)果，得到的推論卻不完全相同。除了2種標(biāo)記檢測的位點不同，以及目前明確的晚疫病菌基因組中存在大量重復(fù)片段和重排現(xiàn)象之外[17-18]；值得關(guān)注的是，馬鈴薯晚疫病菌為單細(xì)胞、多核的二倍體卵菌；異宗配合產(chǎn)生的后代群體，理論上都應(yīng)該屬于雜合體，但卻表現(xiàn)出不同的交配類型[17-18], 由此推測，對峙培養(yǎng)中自育型和A1A2交配型的出現(xiàn)可能與培養(yǎng)條件和所用標(biāo)準(zhǔn)菌株有關(guān)。

圖3 基于A2交配型特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增檢測Fig.3 Results of mating type detection based on A2 specific DNA method with same line order

本研究未檢測到自育型菌株的出現(xiàn), 說明2010年田間有性生殖風(fēng)險較低。本實驗結(jié)果證實云南省馬鈴薯晚疫病菌群體的交配型變化與歐洲一些國家類似，出現(xiàn)由A1交配型占絕對優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)橐訟2交配型菌株為主的特殊現(xiàn)象[15], 盡管原因尚不清楚，卻暗示晚疫病菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)可能出現(xiàn)更加復(fù)雜的變化。A2交配型的出現(xiàn)和增多，增加了田間有性生殖的可能性，這將直接導(dǎo)致菌株的遺傳結(jié)構(gòu)改變、無毒基因變異、抗藥性增強(qiáng)及侵染周期的提前，使得云南省馬鈴薯主栽品種面臨抗性丟失及病害大面積發(fā)生的危險，因此，下一步急需加強(qiáng)云南省馬鈴薯晚疫病菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)的動態(tài)監(jiān)測及流行規(guī)律的深入研究工作。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Comparison of Methods for Detecting Mating Type inPhytophthorainfestans

MIAO Yun-qin, MENG Ran-ran, TANG Wei, YANG Xian, LI Can-hui*

(Root and Tuber Crops Research Institute, Yunnan Normal University, Yunnan Kunming 650500，China)

Potato late blight (PLB) was the most serious potato disease in Yunnan, during the decades and PLB became a dominant and persistent problem of potato production, furthermore.The risk of sexual reproduction was going to higher since both two mating type was found in 1998. This research collected 86 isolates ofPhytophthorainfestansfrom the mainly potato planted areas in Yunnan, aimed to compare two PCR methods (CAPs and A2 specific marker) with the paring culture method. The results confirmed that both of the molecular detection methods could distinguish A1 and A2 mating type, but failed to differentiate between A2 and A1A2 mating type. Meanwhile, this research also found that isolates with A2 mating type contributed up to 82.56 % among tested isolates, which was becoming the dominant lineage in Yunnan province.

Phytophthorainfestans; Mating type; Pairing culture; Molecular marker based detection

1001-4829(2016)07-1525-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.006

2014-05-30

農(nóng)業(yè)部公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)科研專項(3-20);云南省科技廳(2008CA027、2008PY053和2009BB01)

繆云琴(1987-)，女，碩士研究生，生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail: mmiaoyunqin@163.com,*為通訊作者，E-mail: ch2010201@163.com。

S532

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