沼澤型水牛VASA基因啟動子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性檢測

段安琴，龐春英，朱 鵬，鄧廷賢，陸杏蓉，陳明棠，楊炳壯，梁賢威

(中國農(nóng)業(yè)科學院 廣西水牛研究所 廣西水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西 南寧 530001)

?

沼澤型水牛VASA基因啟動子的克隆及轉(zhuǎn)錄活性檢測

段安琴，龐春英，朱 鵬，鄧廷賢，陸杏蓉，陳明棠，楊炳壯，梁賢威

(中國農(nóng)業(yè)科學院 廣西水牛研究所 廣西水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西 南寧 530001)

【目的】 克隆沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列，對啟動子進行生物信息學分析及轉(zhuǎn)錄活性檢測，為后續(xù)水牛繁殖性能的分子機理研究奠定基礎?！痉椒ā?根據(jù)GenBank已公布的河流型水牛(Bubalusbubalis)的VASA5′ 側(cè)翼序列，經(jīng)過同源比對，設計PCR引物。以沼澤型水牛血液基因組為模板擴增VASA基因5′ 側(cè)翼序列并進行測序和生物信息學分析。將擴增的VASA基因5′ 側(cè)翼片段插入pEGFP-1多克隆位點處，構建pVASA-EGFP-1載體。載體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細胞系，分析其轉(zhuǎn)錄活性。【結果】 成功克隆沼澤型水牛VASA5′側(cè)翼序列及部分CDS區(qū)序列，共3 081 bp，同源性分析表明，沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列與河流型水牛、黃牛、綿羊、山羊、小鼠和人的相似性分別為99%，96%，93%，95%，90%和79%。對其5′側(cè)翼序列2 000 bp進行啟動子預測及轉(zhuǎn)錄因子結合位點預測，發(fā)現(xiàn)在其翻譯起始位點上游-635--586處存在TATA box，啟動子區(qū)存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子結合位點，其中Stat家族基因在VASA啟動子區(qū)存在多個結合位點，且同一位點又存在多個Stats基因結合的情況。水牛VASA啟動子能啟動EGFP在HEK-293T細胞中的表達，但非常微弱；能啟動EGFP在CHO細胞中表達，且啟動活性與CMV啟動子相似?！窘Y論】 成功克隆了沼澤型水牛VASA基因啟動子，分析了其啟動子序列特征并成功驗證其組織特異性和轉(zhuǎn)錄活性。

沼澤型水牛；VASA基因；生物信息學分析；轉(zhuǎn)錄活性

水牛具有適應性強、耐高溫高濕、耐粗飼、抗病力強、使用年限長、靜默發(fā)情、繁殖力低和產(chǎn)奶量低等生物學特點，非常適合于我國南方地區(qū)養(yǎng)殖[1-2]。近年來，隨著生活水平的提高，人們對水牛肉和水牛奶的需求日益增加，但是水牛繁殖力低嚴重制約了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而造成這一現(xiàn)狀的主要原因是水牛性成熟晚，屬季節(jié)性發(fā)情動物，產(chǎn)后卵巢長時間不活動，發(fā)情癥狀不明顯，懷孕率低，各地調(diào)查的繁殖率為30%～60%。通過超數(shù)排卵結合活體采卵技術(ovum pick up,OPU)每個水牛卵巢可以獲得2～25 枚卵母細胞[3-4]，而黃牛平均獲得的卵母細胞則高達(30.84±0.88) 枚[5]。因此，亟待應用動物生物技術尤其是基因改良技術開發(fā)利用水牛這一龐大的畜種資源，提高其繁殖力及生產(chǎn)性能，但是當前關于水牛繁殖分子機制的研究較少[6-10]。VASA(又稱DDX4)編碼依賴ATP的RNA解旋酶，屬于DEAD-box RNA蛋白家族，是調(diào)控生殖系統(tǒng)發(fā)育的重要因子[11]。在大多數(shù)動物中，VASA基因僅在生殖細胞系中特異性表達，已成為公認的原始生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)和生殖細胞的理想分子標記物，廣泛用于研究生殖細胞的產(chǎn)生、遷移和分化途徑[12]。鑒于此，本研究克隆了沼澤型水牛VASA基因5′端側(cè)翼序列，對其序列特征進行生物信息學分析，并構建pVASA-EGFP-1真核表達載體，轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞和CHO細胞，分析VASA啟動子的表達特異性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物、細胞及載體 試驗用沼澤型水牛選自中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所水牛養(yǎng)殖基地。試驗所用pEGFP-1載體、HEK-293T細胞和CHO細胞，均為中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 血液基因組提取試劑盒TIANamp Marine Animals DNA Kit、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，均購自天根生化科技有限公司；去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒，購自OMEGA公司；LATaq酶、AgeⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶、pMD18-T Vector，均購自大連TaKaRa公司；T4連接酶，購自Fermentas公司；DMEM高糖基礎液體培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine 3000, Invitrogen)等，均購自Life公司。其他試劑無特殊說明均購自Sigma公司。

倒置熒光顯微鏡(Nikon)，0.22 μm過濾器(Millipore)。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計與合成 以GenBank中河流型水牛VASA基因序列(GenBank登錄號：NW 005785580.1)為參考，進行同源比對，根據(jù)In-Fusion引物設計特點，應用Oligo 6.0軟件針對VASA的同源保守區(qū)域設計1對引物：VASA-F,5′-TACCGGACTCAGATCTGCTAGCCTAAACCG-TGCTTGTCTTTTTTTCAC-3′；VASA-R,5′-CA-TGGTGGCGACCGGTTGCTAATAATATTATA-CCC-3′。VASA-F和VASA-R 5′端下劃線處為In-Fusion引物同源區(qū)域。引物預期擴增VASA基因5′ 端側(cè)翼序列長度為3 081 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 水牛血液基因組的提取及5′ 端側(cè)翼序列PCR擴增 嚴格按照血液基因組提取試劑盒TIANamp Marine Animals DNA Kit操作說明書提取水?；蚪M。PCR反應體系20 μL：模板1 μL，上、下游引物(均20 μmol/L)各1 μL，PrimeSTAR Max Premix(2×) 10 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件為：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后膠回收并進行TA克隆，送至上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定。

1.2.3 pVASA-EGFP-1真核表達載體的構建 應用AgeⅠ和BglⅡ雙酶切骨架載體pEGFP-1，酶切體系及方法嚴格按照酶的使用說明書進行，酶切3 h后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按膠回收試劑盒說明書進行膠回收。應用In-Fusion技術構建pVASA-EGFP-1真核表達載體，In-Fusion連接體系：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，PCR膠回收產(chǎn)物 6 μL，線性化骨架載體 2 μL。反應條件為：50 ℃、15 min后4 ℃保存。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取克隆，37 ℃搖菌16 h擴增質(zhì)粒，通過OMEGA去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，陽性質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定。

1.2.4 生物信息學分析 應用NCBI數(shù)據(jù)BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對沼澤型水牛VASA測序結果進行同源序列比對；應用MEGA5.0軟件進行進化樹構建；應用Promoter軟件(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 和Softberry軟件(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter)進行啟動子預測；用Gpminer軟件(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php) 進行啟動子、轉(zhuǎn)錄因子預測；用Jaspar軟件(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl?rm=browse&db=core&tax_group=vertebrates) 進行轉(zhuǎn)錄因子預測；用Methprimer軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) 進行CpG島預測。

1.2.5 pVASA-EGFP-1真核表達載體轉(zhuǎn)錄活性的檢測 HEK-293T和CHO細胞系用含體積分數(shù)10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天傳代。按照Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說明書，將陽性對照載體pEGFP-N1、陰性對照載體pEGFP-1及所構建的pVASA-EGFP-1載體分別轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細胞系，48 h后置于倒置熒光顯微鏡下檢測EGFP的表達情況。

2 結果與分析

2.1 沼澤型水牛VASA5′端側(cè)翼序列的克隆

以沼澤型水牛血液基因組為模板，應用設計的特異性引物進行擴增，獲得了3 081 bp的特異性條帶(圖 1)，與預期結果一致。

2.2 pVASA-EGFP-1真核表達載體的鑒定

通過In-Fusion技術構建了pVASA-EGFP-1真核表達載體，獲得7 229 bp陽性重組質(zhì)粒(圖2)，進行測序分析，獲得沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列。將測序結果與河流型水牛進行比對，基因相似性為99%，表明重組質(zhì)粒所克隆的基因為沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列。

1.λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker；2.樣品PCR VASA擴增產(chǎn)物 PCR product

1.Supercoiled DNA Ladder；2.pVASA-EGFP-1

2.3 沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列分析

應用NCBI的BLAST軟件相似性比對分析顯示，沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列與河流型水牛、黃牛、綿羊、山羊、小鼠和人的相似性分別為99%，96%，93%，95%，90%和79%，表明VASA基因在不同哺乳動物中具有較高的序列保守性。選取部分沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列與黃牛、小鼠、綿羊、山羊和人進行多重序列比較，結果(圖3)表明，沼澤型水牛VASA基因序列與黃牛具有較高的相似性，與人的該序列差別較大。

2.4 沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列系統(tǒng)進化分析

應用MEGA5.0軟件，用NJ法構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖4。由圖4可知，沼澤型水牛與河流型水牛的相應序列聚為一支，與黃牛的遺傳距離相對較近，進化樹的形態(tài)與分類學保持了較高的一致性，進一步說明克隆的為水牛VASA基因5′側(cè)翼序列。

圖 3 沼澤型水牛與其他物種VASA基因5′側(cè)翼序列的多重比對

圖 4 沼澤型水牛與其他物種VASA基因5′側(cè)翼序列的系統(tǒng)進化樹

2.5 沼澤型水牛VASA基因啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的生物信息分析

Promoter和Softberry在線網(wǎng)站預測結果均顯示，在翻譯起始位點上游-635--586區(qū)域存在啟動子特征序列，序列為TCAAAGAAACTAAAT-AAACCCCACGGGAAATGTCGTACCCAGTTT-TGAAG，其中序列CTAAATAAACCCCAC為TA-TA box元件，應用Jaspar和Gpminer軟件進一步分析發(fā)現(xiàn)，啟動子特征序列附近存在TBP(-625--611)、SP1(-694--632)、CEBPA (-825--805,-554--544)和USF1 (-825--805)等順式作用元件位點，分別結合TATA box、GC box、CAAT box和E box等反式作用因子(圖5)；此外在沼澤型水牛VASA基因5′側(cè)翼序列2 000 bp內(nèi)，也存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Smad2、Smad3、Smad4和Gata3等反式作用因子結合位點，其中Stat家族基因在VASA基因啟動子區(qū)存在多個結合位點，且VASA同一位點處存在多個Stat家族基因結合的情況(圖5)。Methprimer對VASA基因5′側(cè)翼序列預測發(fā)現(xiàn)，在其翻譯起始位點上游1 163-1 456存在CpG島(圖6)。

圖 5 沼澤型水牛VASA啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結合位點分布圖

圖 6 沼澤型水牛VASA啟動子區(qū)CpG島的預測

2.6 pVASA-EGFP-1真核表達載體轉(zhuǎn)錄活性的檢測

將陽性對照載體pEGFP-N1、陰性對照載體pEGFP-1及所構建的pVASA-EGFP-1載體分別轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細胞系，結果見圖7。

A、B.pEGFP-N1轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞；C、D.pEGFP-1轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞；E、F.pVASA-EGFP-1轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞；G、H.pEGFP-N1轉(zhuǎn)染CHO細胞；I、J.pEGFP-1轉(zhuǎn)染CHO細胞；K、L.pVASA-EGFP-1轉(zhuǎn)染CHO細胞；A、C、E、G、I、K.明場；B、D、F、H、J、L.熒光

由圖7可以看出，陽性對照載體pEGFP-N1在HEK-293T和CHO細胞系中均表達EGFP蛋白，且在HEK-293T中的熒光信號顯著強于CHO細胞系(圖 7-B、H)；陰性對照載體pEGFP-1在HEK-293T和CHO細胞系中均無EGFP蛋白表達(圖 7-D、J)；所構建的載體pVASA-EGFP-1在HEK-293T細胞系中表達EGFP蛋白，但很微弱，在CHO細胞系中也表達EGFP蛋白，其表達強度與pEGFP-N1相似，即載體pVASA-EGFP-1的啟動子強度與載體pEGFP-N1的CMV啟動子相似 (圖 7-F、L)。

3 討 論

VASA是公認的生殖標記物,對生殖系統(tǒng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)功能。通過將果蠅的VASA敲除，發(fā)現(xiàn)其具有正向調(diào)節(jié)生殖細胞發(fā)育和維持的功能[13-14]。小鼠VASA從原始生殖脊時期到減數(shù)分裂后期持續(xù)表達，且雄雌皆如此[15]。 雌性VASA敲除小鼠在生殖方面表現(xiàn)正常；而雄性VASA敲除小鼠由于精母細胞在減少分裂Ⅰ期中細線期到偶線期過渡時受阻，致使不育[16]。然而將雌性果蠅VASA突變，將會影響卵子的發(fā)生，導致雌性果蠅不孕及胚胎發(fā)育時期不能形成生殖細胞[14]。由此可見，VASA在不同物種間對生殖細胞的作用有所差異。本研究構建了pVASA-EGFP-1表達載體，為后續(xù)研究VASA啟動子綠色熒光蛋白基因在水牛生殖細胞中的特異性表達奠定了基礎，促進了VASA基因?qū)λＩ臣毎饔脵C制的研究。

本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，VASA在哺乳動物中具有高度的保守性。在水牛VASA啟動子區(qū)內(nèi)的核心啟動子區(qū)，其中一處為-544至-825區(qū)域，此區(qū)域存在TBP、SP1、CEBPA和USF1等結合位點，此外還存在Gata3、SMADs、STATs等反式作用因子結合位點，且存在Stat3,4,5a,5b和Stat6同時結合的位點，暗示STATs可能通過形成二聚體的形式調(diào)控VASA的表達。通過構建pVASA-EGFP-1表達載體并將其轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細胞發(fā)現(xiàn)，VASA5′側(cè)翼序列能夠啟動綠色熒光蛋白表達于CHO細胞中，但不能啟動其表達于HEK-293T細胞中，表明所克隆獲得的沼澤型水牛VASA5′側(cè)翼序列具有組織表達特異性。

成功克隆了沼澤型水牛VASA5′側(cè)翼區(qū)域，并驗證了其轉(zhuǎn)錄活性。但對其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制仍不明確，需通過構架啟動子區(qū)不同缺失片段的熒光素酶報告載體或序列突變來驗證預測調(diào)控元件的真實性，以及對其核心區(qū)域的SNPs、甲基化狀態(tài)和乙?；秸归_進一步研究。

4 結 論

成功克隆獲得沼澤型水牛VASA5′側(cè)翼序列及部分CDS區(qū)，共3 081 bp，同源性分析等表明,其與河流型水牛和黃牛的序列相似性較高。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了可能對沼澤型水牛VASA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的潛在順式作用元件。通過構建pVASA-EGFP-1表達載體轉(zhuǎn)染HEK-293T和CHO細胞，驗證了其轉(zhuǎn)錄活性和組織特異性。

[1] Nandi S,Raghu H M,Ravindranatha B M,et al.Production of buffalo (Bubalusbubalis) embryosinvitro:premises and promises [J].Reprod Domest Anim,2002,37(2):65-74.

[2] Zicarelli L,Esposito L,Campanile G,et al.Effects of using vasectomized bulls in artificial insemination practice on the reproductive efficiency of Italian buffalo cows [J].Anim Reprod Sci,1997,47(3):171-180.

[3] Manjunatha B M,Ravindra J P,Gupta P S,et al.Oocyte recovery by ovum pick up and embryo production in river buffaloes (Bubalusbubalis) [J].Reprod Domest Anim,2008，43(4):477-480.

[4] Di Francesco S,Novoa M V,Vecchio D,et al.Ovum pick-up andinvitroembryo production (OPU-IVEP) in Mediterranean Italian buffalo performed in different seasons [J].Theriogenology,2012，77(1):148-154.

[5] Pontes J H,Melo Sterza F A,Basso A C,et al.Ovum pick up,invitroembryo production,and pregnancy rates from a large-scale commercial program using Nelore cattle (Bosindicus) donors [J].Theriogenology,2011，75(9):1640-1646.

[6] 崔奎青,劉慶友,李秀林,等.基于線粒體控制區(qū)變異的水牛群體遺傳分析 [J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2013(1):76-82.

Cui K Q,Liu Q Y,Li X L,et al.Phylogenetic analysis of water buffalo based on the polymorphism of mitochondrial D-loop [J].Journal of South China Agricultural University,2013(1):76-82.

[7] 崔奎青,張會娜,劉 帥,等.沼澤型水牛NANOG基因5′調(diào)控序列克隆與功能分析 [J].畜牧獸醫(yī)學報,2013,44(3):387-394.

Cui K Q,Zhang H N,Liu S,et al.Cloning and function analysis of swamp buffaloNANOGgene 5′ regulatory region [J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2013，44(3):387-394.

[8] 鄧彥飛,劉真真,李云芳,等.不同逆轉(zhuǎn)錄載體系統(tǒng)應用于水牛胎兒成纖維細胞轉(zhuǎn)基因的探索 [J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2013(4):558-563.

Deng Y F,Liu Z Z,Li Y F,et al.Infection of buffalo fetal fibroblasts by two retrovirus systems [J].Journal of South China Agricultural University,2013(4):558-563.

[9] 龔 云,喬樹葉,林 浪,等.水牛YY1基因克隆及其shRNA片段的篩選 [J].畜牧獸醫(yī)學報,2014,45(1):62-68.

Gong Y,Qiao S Y,Lin L,et al.Cloning of buffaloYY1 gene and screening its shRNA fragments [J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2014,45(1):62-68.

[10] 蘇 節(jié),劉慶友,朱 鵬,等.沼澤型水牛CYP19A1基因克隆、序列分析及組織表達研究 [J].畜牧獸醫(yī)學報,2013，44(4):514-521.

Su J,Liu Q Y,Zhu P,et al.Cloning and sequence analysis of swamp buffalo CYP19A1 gene and determination of its expression pattern in different tissues [J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2013，44(4):514-521.

[11] Hay B,Jan L Y,Jan Y N.A protein component of Drosophila polar granules is encoded by Vasa and has extensive sequence similarity to ATP-dependent helicases [J].Cell,1988,55(4):577-587.

[12] Park E S,Tilly J L.Use of DEAD-box polypeptide-4 (Ddx4) gene promoter-driven fluorescent reporter mice to identify mitotically active germ cells in post-natal mouse ovaries [J].Mol Hum Reprod,2015,21(1):58-65.

[13] Lasko P F,Ashburner M.The product of the Drosophila gene Vasa is very similar to eukaryotic initiation factor-4A [J].Nature,1988,335(6191):611-617.

[14] Johnstone O,Lasko P.Interaction with eIF5B is essential for Vasa function during development [J].Development,2004,131(17):4167-4178.

[15] Noce T,Okamoto-Ito S,Tsunekawa N.Vasa homolog genes in mammalian germ cell development [J].Cell Struct Funct,2001,26(3):131-136.

[16] Tanaka S S,Toyooka Y,Akasu R,et al.The mouse homolog of Drosophila Vasa is required for the development of male germ cells [J].Genes & Development,2000,14(7):841-853.

Cloning and transcriptional activity ofVASAgene promoter of swamp buffalo

DUAN Anqin,PANG Chunying,ZHU Peng,DENG Tingxian,LU Xingrong,CHEN Mingtang,YANG Bingzhuang,LIANG Xianwei

(GuangxiBuffaloResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,GuangxiKeyLaboratoryofBuffaloGenetics,BreedingandReproduction,Nanning,Guangxi530001,China)

【Objective】 Cloning and bioinformatics analyses ofVASA5′flanking sequence were conducted to lay foundation for investigating molecular regulatory mechanism of swamp buffalo reproduction.【Method】 PCR primers ofVASA5′flanking were designed according to the homologous sequence inBubalusbubalispublished in GenBank.TheVASA5′flanking fragment was cloned by PCR and then bioinformatics analysis was conducted.This fragment was then inserted into pEGFP-1 reporter vector to construct pVASA-EGFP-1 vector.Transcription activity was analyzed by transfecting the vector into HEK-293T and CHO cell lines.【Result】 The 3 081 bpVASA5′ flanking and partial CDS region of swamp buffalo were successfully cloned and sequenced.The sequence showed high homologous with river type buffalo,cattle,sheep,goat,mouse and human with nucleotide similarities of 99%,96%,93%,95%,90% and 79%,respectively.A TATA box was predicted at the -635――586 from the translation initiation site,and other transcription factor binding sites of Nobox,Stat1,Stat3,Stat4,Stat5a,Stat5b,Stat6,Gata3 and Smad2,Smad3,Smad4.Many potential binding sites of Stat family genes were also found in theVASApromoter region.The promoter ofVASAgene could weakly activate EGFP expression in HEK-293T cells,and activate it in CHO cells lines as strong as promoted by CMV promoter.【Conclusion】 The promoter ofVASAgene was successfully cloned,its sequence features were analyzed and its tissue specificity and transcriptional activity were verified.

swamp buffalo;VASAgene;bio-informatics analysis;transcriptional activity

時間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.002

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.004.html

2015-04-30

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重點項目(2014ZX08010-012B)；廣西科技攻關國際交流與合作項目(桂科合14123001-5)；廣西水牛研究所基本業(yè)務費項目(水?；?60206)

段安琴(1988-)，女，廣西柳州人，實習研究員，碩士，主要從事細胞生物學研究。E-mail：duanaq321@163.com

梁賢威(1962-)，男，廣西欽州人，研究員，博士，主要從事動物繁殖和營養(yǎng)研究。E-mail：liangbri@126.com

S823.8+3；Q78

A

1671-9387(2016)11-0008-07