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    采用人腫瘤類器官研究阻斷Wnt信號(hào)治療大腸癌的可行性

    2016-12-21 16:03:50查娟民林倩李華善何偉奇
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2016年27期
    關(guān)鍵詞:大腸癌抑制劑

    查娟民+林倩+李華善++何偉奇

    [摘要] 目的 建立和優(yōu)化大腸癌患者腫瘤類器官培養(yǎng)體系,為研究阻斷Wnt信號(hào)治療大腸癌提供新模型。 方法 選擇大腸癌患者18例,收集癌組織及癌旁組織配對(duì)標(biāo)本。采用定量PCR測(cè)定癌組織和癌旁組織Wnt3 mRNA和腸干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5、Ascl2的表達(dá)水平。術(shù)中采集腫瘤組織,使用類器官培養(yǎng)基培養(yǎng)腫瘤類器官。使用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理腫瘤類器官,觀察IWP-2對(duì)腫瘤類器官形態(tài)、生長(zhǎng)等的影響。 結(jié)果 定量PCR表明,與癌旁組織相比,腫瘤組織中的Wnt3表達(dá)水平較高[分別為(1.00±0.08)和(2.99±0.27),P<0.01]。癌旁組織和腫瘤組織Lgr5 [分別為(1.00±0.05)和(5.63±1.80),P<0.01)]、Ascl2[分別為(1.00±0.39)和(4.03±0.33),P<0.05]的表達(dá)水平也較高。IWP-2處理可顯著抑制腫瘤類器官生長(zhǎng)[未處理和處理后類器官面積分別為(10.02±1.34)×104 m2和(2.97±0.62)×104 m2,P<0.01]。 結(jié)論 Wnt信號(hào)通路激活和大腸癌發(fā)生密切相關(guān),抑制Wnt信號(hào)可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),可能是治療大腸癌的一種有效方法。腫瘤類器官可以作為篩選大腸癌治療藥物的一種模型。

    [關(guān)鍵詞] 大腸癌;類器官;Wnt信號(hào);抑制劑

    [中圖分類號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2016)27-0005-04

    Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控腸上皮干細(xì)胞(intestinal stem cell,ISC)增殖和分化的關(guān)鍵信號(hào)[1,2]。結(jié)直腸腫瘤是目前常見的惡性腫瘤之一。腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell,IEC)轉(zhuǎn)變?yōu)槟c癌細(xì)胞和一系列促癌因子的激活和抑癌因子失活密切相關(guān)。腸癌發(fā)生的促發(fā)大多由Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白APC和β-catenin的突變引起,此信號(hào)通路突變后導(dǎo)致β-catenin的穩(wěn)定和隨后的β-catenin/Tcf復(fù)合物的持續(xù)轉(zhuǎn)錄激活,激發(fā)了干細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腺瘤的發(fā)生[1,3,4]。Wnt信號(hào)通路的激活刺激腸干細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)腸干細(xì)胞增殖和癌變,是大腸癌發(fā)生的關(guān)鍵原因,也可能是有效治療大腸癌的靶點(diǎn)[5,6]。然而目前對(duì)大腸癌的研究多采用體外細(xì)胞系培養(yǎng)或者小鼠模型,缺乏原代培養(yǎng)的大腸癌模型。本研究檢測(cè)了癌組織和癌旁組織Wnt3和腸干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5、Ascl2的表達(dá)水平,證實(shí)了腸癌組織中Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子Wnt3表達(dá)上升,提示腸癌組織中Wnt信號(hào)活化。干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5和Ascl2表達(dá)上升。Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的增殖和癌變。本研究建立了結(jié)腸腫瘤患者結(jié)腸類器官(organoids)培養(yǎng)體系,將對(duì)大腸癌患者的腫瘤組織進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng),并且與患者組織高度相似。使用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理結(jié)腸腫瘤類器官,本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IWP-2可抑制大腸癌類器官的生長(zhǎng)。Wnt信號(hào)抑制劑有治療大腸癌的潛能。本研究利用大腸癌類器官,探討了阻斷Wnt信號(hào)通路治療結(jié)直腸腫瘤的可行性,大腸癌類器官可以作為一個(gè)研究大腸癌發(fā)生機(jī)制、篩選治療大腸癌藥物的模型,為今后推動(dòng)臨床預(yù)防和治療大腸癌提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選擇蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2015年1月~2016年1月收治的大腸癌患者18例,年齡30~78歲(中位數(shù)50歲)。收集癌組織和癌旁組織各18份。

    1.2 患者組織中基因表達(dá)檢測(cè)

    收集大腸癌患者癌組織和癌旁正常組織,使用TRIzol(Invitrogen)提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(iScriptTM cDNA Synthesis Kit,Bio-Rad,體系為5×iScript Reaction Mix,4 μl;iScript Reverse Transcriptase,1 μL; RNA template,1 μL;H2O,14 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:2×SYBR Green PCR Master Mix, 12.5 μL;引物,2.0 μL;cDNA template,1.0 μL;滅菌水,9.5 μL;共25 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 60 s,40個(gè)循環(huán)(Thermo Fisher,4309155)。采用GAPDH作為內(nèi)參和Comparative Delta-delta Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。所用實(shí)時(shí)定量PCR儀為CFX96(Bio-rad),所用試劑SYBR Green Realtime PCR Master Mix購(gòu)自Toyobo。GAPDH,forward primer:5-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3,reverse primer:5-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3。Wnt3,forward primer: 5-CTC GCT GGC TAC CCA ATT TG-3,reverse primer:5-AGG CTG TCA TCT ATG GTG GTG-3。Lgr5,forward primer:5-CTC CCA GGT CTG GTG TGT TG-3,reverse primer:5- GAG GTC TAG GTA GGA GGT GAA G-3。Ascl2,forward primer:5-CCC TCC AGC AGC TCA AGT TA-3,reverse primer:5-GGC ACC AAC ACT TGG AGA TT-3。

    1.3 大腸癌腫瘤組織的分離

    對(duì)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院大腸癌患者,術(shù)中開腹后取1~2 cm腸段,投入含有青霉素和鏈霉素的PBS(不含Ca2+、Mg2+)緩沖液中,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作??v向切開腸管,經(jīng)過反復(fù)漂洗后,再橫向切成約1.0 cm×1.0 cm的小塊。組織黏膜層朝上,用大頭針固定在有機(jī)硅樹脂包被的培養(yǎng)皿上。加上4°C預(yù)冷Ca2+、Mg2+螯合溶液(含有2 mM EDTA的PBS),將整個(gè)培養(yǎng)皿置于冰上,搖動(dòng)30 min。將螯合溶液換成PBS之后,在體視鏡下,用手術(shù)鑷將黏膜層從黏膜下層和連接組織輕輕刮離。小心將分離出來的黏膜層移到50 mL離心管,150 g,4°C 離心5 min,棄上清后用5 mL PBS重懸,輕輕吹打幾次。取20 μL溶液到載玻片上,在顯微鏡下觀察計(jì)算個(gè)數(shù)。

    1.4 大腸癌腫瘤類器官立體培養(yǎng)

    將含有大腸癌組織的溶液150 g,4°C 離心10 min,棄上清,再用基質(zhì)膠(Matrigel,Basement Membrane Matrix)重懸[(200~500)個(gè)小組織塊/50 μL Matrigel)]。將含有腫瘤組織的Matrigel滴于未加培養(yǎng)基的空白24孔板正中間,每孔50 μL。將24孔板放入37°C培養(yǎng)箱中。30 min后等Matrigel聚合成固態(tài)(Matrigel 4℃時(shí)為液態(tài),室溫下發(fā)生聚合而轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)),取出,加入含有多種生長(zhǎng)因子的人類器官培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成:Advanced DMEM/F12,加入2 mM glutamine,10 mM HEPES,100 U/mL penicillin,100 g/mL streptomycin,2.5 μg/mL Fungizone,1×N2 supplement,1×B27 supplement。使用前添加:100 ng/mL Wnt3a,250 ng/mL R-spondin 1,100 ng/mL Noggin,50 ng/mL EGF,500 nM A-83-01,10 μM SB202190,10 nM[Leu]15-Gastrin 1, 1 mM N-Acetylcysteine 和10 mM Nicotinamide)。Matrigel購(gòu)自BD Biosciences,培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen,生長(zhǎng)因子購(gòu)自PeproTech和R & D。

    每2~3 d換液,大約1周后進(jìn)行傳代。傳代時(shí)將培養(yǎng)板置于生物安全柜中冰盒上,吸去培養(yǎng)基。加入1 mL含預(yù)冷的PBS,反復(fù)吹打直至肉眼看不見塊狀膠體。轉(zhuǎn)入15 mL離心管中,150G 離心5 min,棄上清。將細(xì)胞團(tuán)用Matrigel重懸后,加到新的24孔培養(yǎng)板中。待Matrigel固化后,加入類器官培養(yǎng)基。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以(x±s)表示,對(duì)定量PCR數(shù)值進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1大腸癌腫瘤組織中Wnt3和腸干細(xì)胞因子Lgr5、Ascl2的表達(dá)

    定量PCR結(jié)果表明,與癌旁組織相比,腫瘤組織Wnt3表達(dá)水平較高[分別為(1.00±0.08)和(2.99±0.27),P<0.01;圖1A],腸干細(xì)胞因子Lgr5[分別為(1.00±0.05)和(5.63±1.80),P<0.01;圖1B] 和Ascl2[分別為(1.00±0.39)和(4.03±0.33),P<0.05;圖1C]的表達(dá)水平也較高。

    2.2 大腸癌腫瘤類器官的培養(yǎng)

    大腸癌組織經(jīng)分離后在Matrigel中立體培養(yǎng),第2天可見球形細(xì)胞團(tuán)。3~4 d后迅速長(zhǎng)大。Matrigel給予培養(yǎng)類器官空間支撐,使其能夠立體生長(zhǎng)(圖2A)。

    2.3 Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理抑制結(jié)腸腫瘤類器官生長(zhǎng)

    Wnt信號(hào)通路抑制劑IWP-2處理可顯著抑制腫瘤類器官生長(zhǎng)[未處理的類器官面積:(10.02±1.34)× 104 m2;處理后的類器官面積:(2.97±0.62)×104 m2,P< 0.01)]。見圖2B。

    3 討論

    腸道的內(nèi)壁是一層連續(xù)的腸上皮細(xì)胞。腸干細(xì)胞表達(dá)Wnt富含亮氨酸拉鏈的G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5,Lgr5),分布在隱窩底部,與潘氏細(xì)胞交錯(cuò)排列,處于快速增殖狀態(tài),產(chǎn)生的子細(xì)胞可分化為各種特異的上皮細(xì)胞[7-9]。分化后的腸上皮細(xì)胞沿著隱窩-絨毛軸向上遷移。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控腸上皮干細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵信號(hào)[1,4]。

    在正常腸上皮細(xì)胞中,分泌性的frizzled相關(guān)蛋白(ssecreted frizzled-related proteins,SFRP)與Wnt競(jìng)爭(zhēng)性地同Wnt受體Frizzled結(jié)合,從而拮抗Wnt信號(hào)[9]。當(dāng)Wnt信號(hào)失活,腺瘤息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)復(fù)合物磷酸化β-catenin,導(dǎo)致β-catenin降解,阻止了β-catenin的核內(nèi)聚集,從而不能激活轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor 4,Tcf4)[1]。

    Fearon和Vogelstein于1990年提出腸癌發(fā)生的經(jīng)典分子模型。大部分腸癌來自于原先存在的腺瘤的惡變[10]。腸癌發(fā)生的促發(fā)大多由Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白APC和β-catenin的突變引起,此信號(hào)通路突變后導(dǎo)致β-catenin的穩(wěn)定和隨后的β-catenin/Tcf復(fù)合物的持續(xù)轉(zhuǎn)錄激活,激發(fā)了干細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腺瘤的發(fā)生[11]。

    本研究發(fā)現(xiàn)和正常腸上皮組織相比,大腸癌腫瘤組織中Wnt信號(hào)相關(guān)分子Wnt3表達(dá)上升,提示腸癌組織中Wnt信號(hào)活化。干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5和Ascl2表達(dá)上升,證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的增殖和去分化,可能和腸上皮的癌變相關(guān)。因此,抑制Wnt信號(hào)具有治療大腸癌的潛能。

    作為一種成體干細(xì)胞,腸干細(xì)胞具有自我更新與分化潛能,因此可以將其分離出體內(nèi)并進(jìn)行體外立體培養(yǎng),模擬發(fā)育和疾病過程,并用于進(jìn)一步的科學(xué)研究。近年來新建立起一種腸上皮細(xì)胞體外立體培養(yǎng)方法[12-14],采用這種培養(yǎng)方式,分離出來的腸上皮干細(xì)胞,可在體外生長(zhǎng)形成類似于絨毛-隱窩單元的類器官(organoids)。組成Organoid培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因素包括:(1)富含層粘連蛋白的Matrigel。(2)培養(yǎng)基中的信號(hào)分子組合。包括與表皮細(xì)胞增殖密切相關(guān)的表皮生長(zhǎng)因子(EGF);Wnt信號(hào)激動(dòng)劑R-spondin;BMP信號(hào)抑制子Noggin。這三種信號(hào)分子共同營(yíng)造的環(huán)境與體內(nèi)腸隱窩中的情況十分相似[12]。

    大腸癌嚴(yán)重威脅著人類健康,其發(fā)生主要是因?yàn)槟c道上皮細(xì)胞的功能異常。與細(xì)胞系相比,大腸癌類器官體外立體培養(yǎng)更接近人體內(nèi)的真實(shí)情況。另外,體外培養(yǎng)體系相對(duì)簡(jiǎn)單可控,周期短,可大大加速相關(guān)研究的進(jìn)展。本研究成功建立了大腸癌類器官培養(yǎng)體系。這一培養(yǎng)體系的建立對(duì)腸道干細(xì)胞和大腸癌研究的推動(dòng)作用不言而喻。

    使用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2[15,16],處理結(jié)腸腫瘤類器官,本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IWP-2可抑制大腸癌類器官的生長(zhǎng)。由于抑制Wnt信號(hào)通路具有治療結(jié)腸癌的潛能。本研究還嘗試用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理結(jié)腸腫瘤類器官,本研究發(fā)現(xiàn)IWP-2可抑制大腸癌類器官的生長(zhǎng)。本研究還設(shè)想通過大腸癌類器官培養(yǎng)體系為基礎(chǔ),高效篩選鑒別Wnt信號(hào)通路的小分子抑制劑,為研究大腸癌的發(fā)生機(jī)制、推動(dòng)臨床預(yù)防和治療大腸癌提供證據(jù)。

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    (收稿日期:2016-04-26)

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