聚酰胺樹脂富集金絲草總黃酮工藝研究

吳曉芹， 雷紹南， 牛 蓉， 張月珠， 涂秋金， 倪 林， 葉 舟*

(1.福建省順華信息科技有限公司， 福建 福州 350015；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院， 福建 福州 350002)

?

聚酰胺樹脂富集金絲草總黃酮工藝研究

吳曉芹1,2， 雷紹南2， 牛 蓉2， 張月珠2， 涂秋金2， 倪 林2， 葉 舟2*

(1.福建省順華信息科技有限公司， 福建 福州 350015；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院， 福建 福州 350002)

以總黃酮含量為指標，通過考察靜態(tài)、動態(tài)吸附、洗脫試驗,評價聚酰胺樹脂富集金絲草總黃酮的最優(yōu)工藝，結(jié)果表明:最佳工藝參數(shù)為上樣液黃酮質(zhì)量濃度2 mg·mL-1，上樣量2 BV，加20%乙醇3 BV沖洗雜質(zhì)，用60%乙醇3 BV洗脫總黃酮,富集后總黃酮純度提高至39.10%。因此，采用聚酰胺樹脂富集金絲草總黃酮的效果良好，為金絲草黃酮的分離純化與金絲草總黃酮藥理試驗奠定基礎(chǔ)。

金絲草； 總黃酮； 聚酰胺樹脂； 富集

金絲草[Pogonatherumcrinitum(Thunb.)Kunth]，為禾本科金發(fā)草屬金絲草，多年生草本。中醫(yī)認為，金絲草有清涼散熱，解毒、利尿之功效，全株可入藥(羅永亮,2014)?，F(xiàn)代藥理研究表明金絲草對尿路感染、腎炎、水腫、黃膽型肝炎、感冒高熱等有一定療效。民間常用金絲草煎水當涼茶解暑，對慢性腎功能衰竭有治療作用；相魯閩等(2000)將金絲草煎汁用于治療小兒急性腎小球腎炎，效果極佳；許秀貌(2000)在臨床上將金絲草代茶飲用治療急性腎盂腎炎，也收到很好的效果。金絲草主要成分為黃酮類化合物，且可能為藥效成分(陳國偉等，2010；Zhu et al.,2009；劉麗佳，2013)。而金絲草總黃酮純化工藝僅見林燕如等(2013)采用大孔吸附樹脂法進行研究，但總黃酮純度未得到明確結(jié)果。因此，本試驗采用聚酰胺樹脂吸附法富集金絲草總黃酮，通過單因素試驗優(yōu)選富集工藝參數(shù)，這將為后續(xù)金絲草總黃酮的藥效試驗與分離純化提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

UVmini-1240紫外分光光度計(日本島津)；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；分析天平 TP-214(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；30-60目聚酰胺樹脂、乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；蘆丁對照品(中國藥品生物制品鑒定所)；亞硝酸鈉(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，硝酸鋁、氫氧化鈉(西隴化工股份有限公司)；金絲草(購于福州市西洪路草藥店)，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳偉教授鑒定為Pogonatherumcrinitum(Thunb.)Kunth；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

取金絲草粉末100 g，加60%乙醇2 L，80 ℃加熱回流2 h，過濾；濾渣按上述操作重復(fù)提取一次，合并兩次濾液得到金絲草提取液，減壓回收溶劑至干，備用。

2.2 金絲草提取物總黃酮的測定

2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱定在120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品50.0 mg，置于250 mL的容量瓶中，加入60%的乙醇定容，精密量取5、7.5、10、12.5、15、17.5 mL，分別置于50 mL的容量瓶中，各加60%的乙醇至17.5 mL，加5% NaNO2溶液0.80 mL，搖勻，放置6 min，加10% Al(NO3)3溶液0.80 mL，搖勻，放置6 min，加4% NaOH 10.00 mL，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，于510 nm波長處測定吸光度值。以吸光度A為縱坐標，質(zhì)量濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程：A=12.550C+0.0002(r=1)，線性范圍：0.02-0.07 mg·mL-1。

2.2.2 樣品測定 精密量取適量待測溶液，按照2.2.1方法，測定各樣品溶液A，根據(jù)回歸方程計算總黃酮含量。金絲草總黃酮生藥量含量為32.98 mg·g-1。

2.3 聚酰胺樹脂預(yù)處理

取30-60目聚酰胺樹脂用95%乙醇浸泡過夜，30 ℃烘干，備用。

2.4 上樣液制備

取一定量金絲草浸膏，配制成不同金絲草總黃酮質(zhì)量濃度的上樣液。

2.5 聚酰胺樹脂富集黃酮工藝摸索

2.5.1 吸附等溫曲線 稱取0.5 g 預(yù)處理好的30-60目聚酰胺樹脂，分別加入15個三角瓶中,加入一系列不同黃酮質(zhì)量濃度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1)的樣品水溶液20 mL，置于搖床上振蕩24 h，使其充分吸附,過濾,測定濾液中剩余黃酮濃度(平衡濃度)，計算樹脂的吸附量。結(jié)果見圖1，表明當上樣液總黃酮質(zhì)量濃度達到2 mg·mL-1時，上樣20 mL基本達到吸附飽和。確定吸附量不再增加的最低初始濃度為聚酰胺樹脂柱的上柱濃度，其對應(yīng)的吸附量則為30-60目聚酰胺樹脂的靜態(tài)飽和吸附量。

圖1 上樣液質(zhì)量濃度對金絲草總黃酮吸附量的影響

Figure 1 Effect of sample concentration on adsorption quantity of total flavonoids fromP.crinitum

2.5.2 聚酰胺最佳吸附pH 黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，故pH對其吸附性能具有一定影響。準確稱取聚酰胺樹脂0.5 g，共5份，各加入黃酮濃度為2 mg·mL-1的上樣液20 mL，用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH分別為3、4、5、6、7、8，其他操作如2.5.1。結(jié)果表明，金絲草總黃酮吸附量無明顯差異，因此不對上樣液進行pH調(diào)節(jié)。

2.5.3 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線 稱取聚酰胺樹脂0.5 g，加入黃酮濃度為2 mg·mL-1的上樣液20 mL，置于恒溫搖床上振搖，每隔30 min測一次黃酮濃度，繪制吸附動力曲線。結(jié)果見圖2，表明聚酰胺樹脂吸附金絲草總黃酮速度較快，30 min可基本達到吸附飽和，最后逐漸趨于吸附平衡。

圖2 金絲草總黃酮的靜態(tài)吸附速率曲線

Figure 2 Curve of static adsorption rate of total flavonoids fromP.crinitum

2.5.4 聚酰胺載量曲線 稱取干燥聚酰胺樹脂3 g，量取總黃酮質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的上樣液，以流速1 mL·min-1連續(xù)通過樹脂柱(徑高比1∶10)，收集流出液，每5 mL收集一份，測定A，計算總黃酮含量，繪制泄漏曲線圖。結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示上樣量達到25 mL時，黃酮泄漏率為1.83%，之后隨著上樣液體積的增大，總黃酮泄漏率逐漸增大，故確定樹脂質(zhì)量∶上樣液體積(3∶25)，上樣液體積約為2 BV。

2.5.5 最佳洗脫溶劑 稱取3 g干燥聚酰胺樹脂，取25 mL黃酮濃度為2 mg·mL-1的上樣液。聚酰胺樹脂柱裝好后上樣，上樣結(jié)束后靜置30 min。先用3 BV蒸餾水進行洗脫，收集水洗液，同時檢測是否有黃酮流出，測定水洗液的干膏量。再依次用體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液3 BV進行洗脫，1 BV收集一管，測干膏量與總黃酮濃度。結(jié)果測得水洗液干膏量依次為74.7、6.7、3.9 mg，表明用3 BV水洗即可除去大部分雜質(zhì)。圖4 表明20%乙醇洗脫得到的總黃酮量極低，采用40%乙醇洗脫時總黃酮開始大量被洗脫下來，60%乙醇洗脫時又達到一個峰值，故選擇20%乙醇3 BV洗去雜質(zhì)，60%乙醇作為金絲草總黃酮洗脫溶劑。

圖3 聚酰胺樹脂載量曲線

Figure 3 Curve of adsorption capacity of polyamide resin

圖4 不同體積分數(shù)乙醇洗脫總黃酮濃度曲線

Figure 4 Curve of different volume fraction ethanol and total flavonoid concentration eluted

2.5.6 洗脫溶劑用量 稱取3 g干燥聚酰胺樹脂，按照優(yōu)選的工藝條件進行吸附，加20%乙醇3 BV洗脫除去雜質(zhì)，加3 BV 60%乙醇洗脫總黃酮，洗脫流速為1 mL·min-1，0.5 BV收集一份洗脫液，測定510 nm處吸光度A，計算洗脫液中總黃酮濃度。結(jié)果見圖5，60%乙醇3 BV洗脫即可將大部分黃酮洗脫下來，故60%乙醇用量為3 BV。

圖5 洗脫溶劑用量洗脫總黃酮濃度曲線

Figure 5 Curve of solvent consumption eluted and total flavonoids concentration eluted

2.5.7 驗證試驗 分別稱取3份干燥聚酰胺3 g，裝柱，徑高比為1∶10，取總黃酮濃度為2 mg·mL-1的上樣液25 mL上樣。上樣結(jié)束后，柱子靜置30 min。以1 mL·min-1流速洗脫黃酮，先以3 BV 20%乙醇洗脫雜質(zhì)，再以3 BV 60%乙醇洗脫黃酮，收集乙醇洗脫液，測定出膏率和總黃酮含量。將洗脫液減壓干燥得到20%乙醇洗脫液平均干膏量為89.00 mg，平均總黃酮量為2.50 mg；60%乙醇洗脫液平均干膏量為92.20 mg，平均總黃酮量為36.04 mg；總黃酮純度提高至39.10%，回收率為72.08%，相對標準偏差(RSD)為0.34%，說明回收率試驗的重現(xiàn)性好，該工藝能夠較好提高金絲草黃酮純度。

3 小結(jié)與討論

Wang et al.(2008)發(fā)現(xiàn)金絲草甲醇提取液中的黃酮類化合物可以顯著抑制經(jīng)脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7細胞的iNOS表達，進而抑制NO的大量產(chǎn)生，減少NO對細胞的毒害，有利于緩解炎癥反應(yīng)。由于慢性腎功能不全的腎臟對iNOS的降解能力低，不能有效地控制具有細胞毒性的NO不斷地產(chǎn)生和釋放，從而加重了對腎臟組織的損傷。據(jù)臨床資料收集分析，金絲草對部分慢性腎衰具有較好的效果。本文對金絲草總黃酮的富集工藝進行探討，為金絲草黃酮治療慢性腎衰的藥理研究與金絲草黃酮類化合物的進一步分離純化作前期準備。

林燕如等(2013)研究了大孔樹脂分離純化金絲草總黃酮，但其純度未得到明確的結(jié)果。大孔樹脂是物理吸附，且廠家不同，性能有所不同，其分離效果沒有聚酰胺好；聚酰胺是氫鍵吸附，適用于黃酮類成分的分離，具有選擇性高、操作簡便、吸附與解吸速度快、吸附量大等優(yōu)點，但聚酰胺由于粒度不均勻，可以通過使用脫脂棉裝柱代替有砂芯的柱子或者裝柱前過篩解決分離時流速較慢的問題。本文通過靜態(tài)、動態(tài)試驗對影響聚酰胺吸附與解吸各種因素的研究，確定了富集金絲草總黃酮的最佳工藝為：上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1，上樣量為2 BV，以3 BV 20%乙醇溶液沖洗雜質(zhì)，3 BV 60%乙醇溶液洗脫總黃酮效果最佳。經(jīng)處理后的金絲草總黃酮純度提高至39.10%，表明聚酰胺樹脂富集金絲草總黃酮有良好的效果。

陳國偉,李鑫,史志龍,等,2010.金絲草脂溶性化學(xué)成分研究[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報,27(2):216-217.

林燕如,謝琳潔,2013.金絲草總黃酮大孔樹脂純化工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),52(10):2 393-2 396.

劉麗佳,2013.金絲草的化學(xué)成分研究Ⅰ[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),25-33.

羅永亮,2014.金絲草治療慢性腎衰小鼠活性成分解析方法的初步探索[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué):4-5.

相魯閩,相魯建,2000.紅背草筆仔草治療小兒急性腎小球腎炎[J].中國民間療法,8(12):45.

許秀貌,2000.金絲草代茶飲治療急性腎盂腎炎[J].中國民間療法,8(10):42.

Wang G J,Chen Y M,Wang M,et al,2008.Flavonoids with iNOS inhibitory activity fromPogonatherumcrinitum[J].Journal of ethnopharmacology,118(1):71-78.

Zhu D,Yang J,Deng X T,et al,2009.A newC-glycosylflavone fromPogonatherumcrinitum[J].Chinese Journal of Natural Medicines,7(3):184-186.

(責(zé)任編輯：陳曉雯)

Polyamide resin for purifying technology of total flavonoids fromPogonatherumcrinitum(Thunb.) Kunth

WU Xiao-Qin1,2, LEI Shao-Nan2, NIU Rong2, ZHANG Yue-Zhu2,TU Qiu-Jin2, NI Lin2, YE Zhou2*

(1.FujianShunhuaInfoTechnologyCo.,Ltd,Fuzhou,Fujian350015,China;2.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

The aim of this paper is to optimize purifying technology of total flavonoids from herba,Pogonatherumcrinitum(Thunb.) Kunth by polyamide resin, and the static and dynamic adsorption and desorption behaviors of polyamide resin were evaluated for achieving an optimal purification of total flavonoids. The results showed that optimum purifying technology parameters were as follows: sample concentration of 2 mg·mL-1, sample volume of 2 BV, eluted impurities with 3 BV of 20%ethanol, then eluted with 3 BV of 60% ethanol, and purity of total flavonoids was up to 39.10%. Purification effect of total flavonoids fromP.crinitumby polyamide resin was feasible, and this study could provide experimental basis for the separation, purification and pharmacological experiment ofP.crinitum.

Pogonatherumcrinitum(Thunb.) Kunth; total flavonoids; polyamide resin; purifying technology

2016-05-10; 發(fā)表日期： 2016-10-31

福州經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)科技計劃項目合同書(2015MW09)。

吳曉芹(1990-),女,碩士。研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。Email：976376758@qq.com。*葉舟(1957-),男,教授。研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。Email：yezhou1182@126.com。

R284.2

A

1001-4276-(2016)01-0127-05

吳曉芹，雷紹南，牛蓉，等,2016.聚酰胺樹脂富集金絲草總黃酮工藝研究[J].武夷科學(xué)，32：127-131.