三七總皂苷預(yù)處理通過激活HIF-1α/BNIP3線粒體自噬信號通路減少心肌細(xì)胞H/R損傷的機(jī)制研究

王麗紅 韓勇 王超海 詹舟虹 盧夢愷 金佳煒 劉新文

紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院（紹興市立醫(yī)院）藥劑科，浙江紹興 312000

心肌缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，隨后恢復(fù)血流和氧氣產(chǎn)生大量氧自由基，這種心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）過程會造成大量心肌細(xì)胞凋亡，引起心肌損傷，減少心肌細(xì)胞H/R 損傷是改善患者預(yù)后的保障[1,2]。線粒體自噬是細(xì)胞自發(fā)清除損傷或衰老線粒體的過程，近年研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬與神經(jīng)退行性疾病和癌癥等諸多生理病理過程密切相關(guān)，這對修復(fù)心肌細(xì)胞H/R 損傷有重要意義，與線粒體自噬相關(guān)的信號通路也逐漸引起研究者的關(guān)注[3,4]。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxic inducible factor-1 α，HIF-1α）是細(xì)胞氧氣信號傳導(dǎo)通路的核心組成部分，常氧下HIF-1α 表達(dá)極為有限，僅在低氧條件下能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定高表達(dá)，HIF-1α 蛋白參與代謝、缺氧適應(yīng)、血管生成和炎癥發(fā)展等重要過程[5]。B 淋巴細(xì)胞瘤-2/腺病毒E1B 19kDa 相互作用蛋白3（b lymphocytoma-2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3）能發(fā)揮促細(xì)胞凋亡和線粒體自噬的重要作用，因此，通過調(diào)節(jié)HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路表達(dá)，能夠調(diào)控線粒體自噬過程，進(jìn)一步在減少心肌細(xì)胞H/R 損傷中發(fā)揮作用[6]。研究表明，三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）可以通過抑制細(xì)胞凋亡減少心肌缺血細(xì)胞，縮小心肌梗死范圍，抑制血小板聚集黏附以及改善微循環(huán)，但其保護(hù)心肌的具體作用機(jī)制尚無定論[7,8]。本研究探討了PNS 是否通過調(diào)節(jié)HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路發(fā)揮減少心肌細(xì)胞H/R損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人H9c2 心肌細(xì)胞購自上海博湖生物科技有限公司；PNS 和二甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME2）由上海廣銳生物科技有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自江蘇齊氏生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司；β-actin 人單克隆抗體LC3、HIF-1α 和BNIP3 單克隆抗體，均購自美國Abcam 公司。CO2培養(yǎng)箱購自ThermoFisher Scientific公司；Infinite 200 PRO 多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN 公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2 心肌細(xì)胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，使培養(yǎng)的H9c2 心肌細(xì)胞完全貼壁。

1.3 H9c2 心肌細(xì)胞H/R 損傷模型建立與分組

1.3.1 H/R 損傷建模方法 待H9c2 心肌細(xì)胞完全貼壁后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100μl 不含F(xiàn)BS的無糖DMEM 培養(yǎng)基（細(xì)胞缺氧液），將細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至密閉缺氧盒中，持續(xù)通氮?dú)?0min 除去氧氣，置于CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)3 h，然后除去細(xì)胞缺氧液，每孔加入100μl 體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)[9]。

1.3.2 分組 ①對照組：即正常心肌細(xì)胞組，按照1.2 步驟常規(guī)培養(yǎng)H9c2 心肌細(xì)胞；②模型組：即經(jīng)過缺氧培養(yǎng)的H/R 損傷的細(xì)胞組，根據(jù)上述1.3.1 的H/R 損傷模型的建立方法，建立H/R 損傷模型，模型組僅建模，不加任何藥物干預(yù)；③2-ME2 組：即在含2-ME2 培養(yǎng)液中培養(yǎng)H/R 損傷的H9c2 心肌細(xì)胞；④PNS組：建立模型的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)液中加入PNS(50μg/ml)，PNS 濃度根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)決定；⑤P NS+2-ME2 組：在培養(yǎng)液中加入2-ME2，10min 后加入PNS(50μg/ml)，培養(yǎng)H/R 損傷的H9c2 心肌細(xì)胞。

1.4 心肌細(xì)胞損傷檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法測定肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate amino transferase，AST）水平。將包被好的酶標(biāo)板用PBS緩沖液沖洗3 次，緩沖液封閉，每孔100μl，37℃下放置30min。封閉好的板加標(biāo)準(zhǔn)品或待測H9c2 心肌細(xì)胞懸浮液各3 孔，每孔50μl，室溫放置4h，每孔加入50μl 酶標(biāo)抗體，室溫反應(yīng)1h，加入底物鄰苯二酚胺1 滴顯色，帶標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度明顯時(shí)用硫酸終止反應(yīng)，讀取490nm 下吸光度值，所有操作嚴(yán)格按照說明書要求執(zhí)行[10]。

1.5 心肌細(xì)胞自噬活性檢測

取各組對數(shù)生長期H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h 后棄培養(yǎng)基，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛固定10min，200μl Triton-X作用30min，采用3%FBS 封閉，加入細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 一抗孵育過夜，加入熒光耦聯(lián)二抗，37℃孵育1h 后封片，熒光顯微鏡下觀察LC3 熒光斑點(diǎn)數(shù)。

1.6 線粒體自噬信號通路表達(dá)檢測

取各組H9c2 心肌細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白，嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，取50ng 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2h，采用洗膜緩沖液洗膜并加一抗（LC3、HIF-1α 和BNIP3），于4℃孵育過夜，洗膜加二抗，于室溫下孵育2h。電化學(xué)發(fā)光顯影，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對比條帶強(qiáng)弱，選用β-actin作為內(nèi)參[11]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，滿足正態(tài)性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理后心肌細(xì)胞損傷比較

與對照組相比，模型組CK、LDH 和AST 水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和PNS+2-ME2 組CK、LDH 和AST水平均明顯降低，2-ME2 組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同處理后心肌細(xì)胞損傷比較（ ）

表1 不同處理后心肌細(xì)胞損傷比較（ ）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

2.2 不同處理后心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激比較

與對照組相比，模型組ROS 含量和MDA 水平均明顯升高，SOD 含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和2-ME2+PNS組MDA 水平和ROS 含量明顯降低，SOD 含量明顯升高；2-ME2 組MDA 水平和ROS 含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同處理后心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激比較（ ）

表2 不同處理后心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激比較（ ）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

2.3 不同處理后心肌細(xì)胞自噬活性比較

免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組心肌細(xì)胞LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和2-ME2+PNS 組心肌細(xì)胞LC3 熒光斑點(diǎn)數(shù)明顯增加，2-ME2 組LC3 熒光斑點(diǎn)數(shù)明顯減少（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同處理后心肌細(xì)胞自噬活性比較

2.4 不同處理后心肌細(xì)胞線粒體自噬信號通路表達(dá)比較

與對照組相比，模型組LC3、HIF-1α 和BNIP3表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和PNS+2-ME2 組LC3、HIF-1α 和BNIP3 表達(dá)水平明顯升高，2-ME2 組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2，表3。

圖2 心肌細(xì)胞線粒體自噬信號通路表達(dá)比較凝膠條帶

表3 不同處理后心肌細(xì)胞線粒體自噬信號通路表達(dá)比較（ ）

表3 不同處理后心肌細(xì)胞線粒體自噬信號通路表達(dá)比較（ ）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

3 討論

AST 在心肌內(nèi)含量豐富，對診斷心肌梗死等疾病有一定意義；發(fā)生心肌損傷時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)外漏至細(xì)胞間液及外周血中，造成LDH 升高；CK 在各種類型進(jìn)行性肌萎縮時(shí)活性增高[12,13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)PNS 干預(yù)后心肌細(xì)胞損傷有所緩解。PNS 預(yù)處理能夠降低心肌細(xì)胞CK、LDH 和AST 水平，說明PNS 具有心肌保護(hù)作用，而2-ME2 組上述水平明顯增加，說明2-ME2 一定程度上會損害心肌細(xì)胞，PNS+2-ME2 組CK、LDH 和AST 水平升高說明PNS能夠逆轉(zhuǎn)2-ME2 的損傷作用。氧化應(yīng)激研究結(jié)果表明模型組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平較高，這可能是其心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重程度高的可能原因之一。使用PNS預(yù)處理后，心肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平有所緩解，2-ME2 減輕H/R 引起的心肌細(xì)胞凋亡，對H/R 損傷的心肌細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用。

LC3 參與自噬體形成，是自噬的重要分子標(biāo)志物之一，為了從自噬的角度進(jìn)一步解釋這種現(xiàn)象，本研究采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測各組心肌細(xì)胞自噬活性[14]。本研究結(jié)果顯示模型組和經(jīng)PNS 干預(yù)的心肌細(xì)胞自噬活性均明顯升高，這可能是因?yàn)楫?dāng)心肌細(xì)胞受損后，機(jī)體為代償性修復(fù)損傷而激活心肌細(xì)胞自噬過程，而PNS 則推進(jìn)了自噬進(jìn)程以促進(jìn)更高效的保護(hù)作用。既往研究結(jié)果顯示，自噬在缺血再灌注過程中具有雙向調(diào)節(jié)作用，這種作用效果取決于對自噬的刺激程度，適度自噬可以清除受損細(xì)胞器發(fā)揮保護(hù)作用，而過度的自噬水平則會進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞[15]。多數(shù)研究者認(rèn)為H/R 發(fā)生的基礎(chǔ)是能量代謝障礙，而線粒體是體內(nèi)能量代謝的主要場所，其功能損傷能夠直接導(dǎo)致機(jī)體能量代謝異常[16]。線粒體對缺氧導(dǎo)致的損傷極為敏感，缺氧早期受損線粒體常通過選擇性自噬發(fā)揮保護(hù)作用。HIF-1α 作為低氧反應(yīng)過程中的核心因子，在介導(dǎo)低氧信號通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，BNIP3 作為一種線粒體外膜蛋白，在缺氧條件下其表達(dá)增加也會促進(jìn)線粒體自噬以清除受損線粒體[17,18]。2-ME2 是不可逆HIF-1α 通路抑制劑，能夠使微管解聚并抑制HIF-1α 核積累以及HIF 轉(zhuǎn)錄活性，抑制線粒體自噬過程，本研究結(jié)果顯示，使用2-ME2 干預(yù)后再加入PNS，這種線粒體自噬效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)，這一結(jié)果從分子學(xué)角度說明PNS 能通過作用于HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路，引起線粒體選擇性自噬，快速清除體內(nèi)受損線粒體，更有效地保護(hù)心肌細(xì)胞[19]。既往研究顯示，BNIP3 在正常生理?xiàng)l件下處于低表達(dá)水平，而當(dāng)細(xì)胞缺氧時(shí)，活化的 HIF-1α 通過上調(diào)BNIP3 引起自噬調(diào)控蛋白Beclin1 從B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因中解離，釋放Beclin1 激活自噬，與本研究結(jié)果基本一致[20]。

綜上所述，本研究分析了 PNS 能夠作用于HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路發(fā)揮減少心肌細(xì)胞H/R 損傷的作用，推進(jìn)了臨床利用線粒體自噬通路提供相關(guān)治療的進(jìn)展。