正交試驗(yàn)優(yōu)選烏藥中去甲異波爾定的提取工藝

劉譯

（湖南省懷化市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 懷化 418000）

正交試驗(yàn)優(yōu)選烏藥中去甲異波爾定的提取工藝

劉譯

（湖南省懷化市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 懷化 418000）

目的 優(yōu)選烏藥中去甲異波爾定的提取工藝。方法 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以去甲異波爾定提取率為考察指標(biāo)，考察提取前浸泡時(shí)間、提取溶劑、提取方法、固液比、提取時(shí)間、提取溫度等因素，同時(shí)測(cè)定干浸膏收率。結(jié)果 最佳方案為提取前浸泡20 min，60%的乙醇水溶液提取溶劑，最終確定提取方法為超聲提取、固液比1∶12、提取時(shí)間為20 min、提取溫度為45℃。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行，可有效提取烏藥中去甲異波爾定的含量，為以烏藥為原料的抗宮炎系列藥品提供質(zhì)量控制依據(jù)。

烏藥；去甲異波爾定；提取工藝；正交設(shè)計(jì)；高效液相色譜法

烏藥來源于樟科植物烏藥 Lauraceae Lindera.aggregata(Sims)Kosterm.的干燥塊根，首載于《本草拾遺》，具有行氣止痛、溫腎散寒的功能，用于寒凝氣滯、胸腹脹痛、氣逆喘急、膀胱虛冷、遺尿尿頻、疝氣疼痛、經(jīng)寒腹痛[1]。烏藥主產(chǎn)于浙江、湖南、安徽、江西等省，以浙江天臺(tái)所產(chǎn)烏藥品質(zhì)最佳。烏藥主要含揮發(fā)油、異喹啉類生物堿、黃酮類及呋喃倍半萜類成分。早期烏藥的質(zhì)量研究主要集中在烏藥內(nèi)酯或?yàn)跛幟褍?nèi)酯等脂溶性成分的含量測(cè)定，后來發(fā)現(xiàn)烏藥中異喹啉類生物堿如去甲異波爾定等水溶性成分也具有一定藥理活性。近年來，逐漸將烏藥生物堿納入質(zhì)量研究體系，2015年版《中國藥典（一部）》烏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增加了去甲異波爾定含量測(cè)定，規(guī)定去甲異波爾定不得少于0.40%。傳統(tǒng)烏藥使用多以水煎煮應(yīng)用于臨床，烏藥干浸膏也為水煎煮提取制成的浸膏[2]。烏藥醚內(nèi)酯易溶于有機(jī)溶劑，去甲異波爾定為異喹啉類生物堿，結(jié)構(gòu)中既含有氮原子也有羥基，屬于既溶于有機(jī)溶劑又溶于水的化合物。已有烏藥中烏藥醚內(nèi)酯提取工藝[3]的相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于從烏藥中提取去甲異波爾定的文獻(xiàn)報(bào)道不多。本研究中以去甲異波爾定提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)選了烏藥中去甲異波爾定的提取工藝參數(shù)，也為以烏藥為原料之一的抗宮炎系列藥品質(zhì)量控制提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT型及SPD－20A型高效液相色譜儀，包括島津四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、SPD檢測(cè)器、LCsolution色譜工作站；TOLEDO XSE105型電子分析天平（Mettler公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；CBL9960A型超聲波清洗器(天津科貝爾光電技術(shù)有限責(zé)任公司)；202－1A型電熱恒溫干燥箱及FW100微型粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

烏藥購于湖南邵東縣廉橋中藥材專業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)懷化市食品藥品檢驗(yàn)所唐勇主任藥師鑒定為樟科山胡椒屬植物烏藥 Lauraceae Lindera.aggregata(Sims)Kosterm.的干燥塊根；去甲異波爾定對(duì)照品（純度為95.7%，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111825－201402）；甲醇、乙腈、甲酸、三乙胺為色譜純；水為二次重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 去甲異波爾定含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件[2]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.5%甲酸和0.1% 三乙胺的水溶液（B），梯度洗脫，0～13 min時(shí)流動(dòng)相A從10%→22%，13～22 min時(shí)流動(dòng)相A維持22%）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長：280 nm；進(jìn)樣量5 μL。理論板數(shù)按去甲異波爾定峰計(jì)算應(yīng)大于5 000。在此條件下，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱取去甲異波爾定對(duì)照品適量，加甲醇－0.5%鹽酸的混合溶液(2∶1)制成每1 mL中含去甲異波爾0.2 mg，搖勻，即得。

供試品溶液：取本品粉末0.5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇－稀鹽酸(0.5%)的混合液(2∶1)25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流并保持微沸1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇－稀鹽酸(0.5%)的混合液(2∶1)補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，0.45 μm濾膜過濾即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液，分別以1.0，2.0，5.0，8.0，10.0，12.0，20.0 μL進(jìn)樣分析。按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程Y＝2 779 017.373X－82 361.461，r＝0.999 49(n＝7)。結(jié)果表明，去甲異波爾質(zhì)量濃度在0.202 8～4.056 0 g／L范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，10，18，24，48 h時(shí)連續(xù)進(jìn)樣3次，各5 μL，測(cè)定去甲異波爾定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.54%（n＝8），表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批烏藥藥材，依法制備6份供試品溶液，精密吸取5 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1.57%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的去甲異波爾定對(duì)照品，照供試品溶液制備方法制備溶液，精密吸取5 μL注入色譜儀中，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，6次加樣回收率均在95%～105%，平均值99.34%，RSD為1.44%（n＝6）。

2.2 干浸膏收率的測(cè)定

取各試驗(yàn)所得的浸膏約1 g，精密稱定，水浴蒸干后，于105℃干燥5 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，再于105℃干燥1 h，冷卻稱定質(zhì)量，至兩次質(zhì)量的差異不超過5 mg為止，記錄干浸膏質(zhì)量，計(jì)算干浸膏收率。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表1 L25(46)正交試驗(yàn)因素水平表

2.3 提取工藝正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)

以去甲異波爾定提取率為考察指標(biāo)，采用 L25(46)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，考察提取前浸泡時(shí)間（因素A）、提取溶劑（因素B）、提取方法（因素C）、固液比（因素D）、提取時(shí)間（因素E）、提取溫度（因素F）6個(gè)因素。水平因素表和試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2，方差分析見表3。

表3 方差分析結(jié)果

對(duì)去甲異波爾定的提取總量(以原藥材計(jì))進(jìn)行分析，由表2及表3可知，影響去甲異波爾定提取率的各因素主次順序?yàn)镃＞B＞A＞E＞D＞F。其中，因素C的影響具有顯著性意義（P＜0.01），因素 B有一定影響（P＜0.1），因素A，E，D，F(xiàn)的影響無顯著性，故確定最佳提取方案為A1B3C2D3E2F4，即提取方法為超聲提取、固液比1∶12、提取時(shí)間為20 min、提取溫度為45℃。在去甲異波爾定的提取率相同的情況下，收膏率越低越好，對(duì)收膏率進(jìn)行直觀分析所得最佳結(jié)果也為A1B3C2D3E2F4。因此，以 A1B3C2D3E2F4為最佳提取工藝方案。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

以A1B3C2D3E2F4方案進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4。各項(xiàng)指標(biāo)的 RSD均＜1.8%，去甲異波爾定的提取率較高，而收膏率較低，表明正交試驗(yàn)所篩選的工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 提取方法選擇

由方差分析可知，影響提取效率最大的因素為提取方法。本試驗(yàn)中通過超聲提取這一物理過程，在整個(gè)浸提過程中基本無化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，這與超聲提取能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量的空化作用，并能產(chǎn)生許多次級(jí)作用有關(guān)[4－5]。超聲提取避免了常規(guī)回流法、煎煮法等長時(shí)間加熱對(duì)烏藥中去甲異波爾定的的不良影響，與傳統(tǒng)方法比較縮短了提取時(shí)間，提高了提取率。

表4 正交試驗(yàn)最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.2 提取溶劑考察

提取溶劑及濃度的選擇對(duì)結(jié)果也有一定影響，用含水的乙醇提取比用純水提取的提取率更高。60%的乙醇水溶液提取去甲異波爾定比用30%乙醇水溶液的提取率要高，而和90%乙醇的提取率差不多，故選用60%的乙醇水溶液。

3.3 提取工藝確定

通過正交試驗(yàn)得到烏藥中去甲異波爾定的最佳提取工藝：提取前浸泡時(shí)間為20 min，提取溶劑為60%的乙醇水溶液，提取方法為超聲提取，固液比1∶12，提取時(shí)間為20 min，提取溫度為45℃。該方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠，可作為烏藥提取去甲異波爾定的參考標(biāo)準(zhǔn)，也可為以烏藥為原料之一的抗宮炎系列藥品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:77.

[2]姚新生.天然藥物化學(xué)[M].第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003:20.

[3]陳方亮，余翠琴，徐仙娥.正交試驗(yàn)優(yōu)選烏藥的提取工藝[J].中草藥，2009，40(7):1 079－1 081.

[4]徐天生，梁 燕，江莉華，等.用正交試驗(yàn)法研究超聲提取丹參多糖的最佳工藝[J].中成藥，2008，30(2):270－271.

[5]楊祖金，鐘 理，謝小霞，等.超聲波法強(qiáng)化提取羅漢果皂甙的工藝研究[J].中藥材，2007，30(8)：1 019－1 021.

Optimization of Extract Technology of Norisoboldine from Radix Linderae by Orthogonal Experiment

Liu Yi
(Huaihua Institute for Food and Drug Contro,Huaihua,Hunan,China 418000)

Objective Tooptimize theoptionalextraction method of norisoboldine from Radix Linderae.Methods Thecontent of norisoboldine was used as index to evaluate the technologies based on orthogonal design,considering ointment rate at the same time,in which the 6 factors were the soaking time before extraction,extraction solvent,extraction method,ratio of solid to liquid,extraction time, and extracting temperature.Results The optimum extraction processes was soaking for 20 min before extraction,60% ethanol,ultrasonic extraction technique,solid－liquid ratio 1∶12,the extraction time was 20 min,the extracting temperature was 45℃.Conclusion The method is simple,stable and feasible.

Radix Linderae;norisoboldine;extraction process;orthogonal experiment;HPLC

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2016)21－0010－04

劉譯（1964－），男，副主任藥師，主要從事中藥研發(fā)、檢驗(yàn)和檢測(cè)，（電子信箱）hhsyjs＠126.com。

2016－07－13)

湖南省食品藥品監(jiān)督管理局2015年度食品藥品安全科技重點(diǎn)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：湘食藥科R201501。