食品中A.hydrophila分析方法研究

羅紅梅

摘要：A.hydrophila原為水生細(xì)菌，廣泛存在于淡水，海水及各河海交會(huì)口，故水產(chǎn)食品常可分離出此菌。除了水產(chǎn)品外，各種生肉類和內(nèi)臟、即食肉類和生菜沙拉等此菌的檢出率為5.15%和22.83%。此外，生牛奶、鮮乳、乳酪和冰淇淋也可分離出A.hydrophila。文章對(duì)食品中的A.hydrophila分析方法進(jìn)行了研究。

關(guān)鍵詞：食品；A.hydrophila分析方法；水生細(xì)菌；水產(chǎn)食品；食品檢測(cè) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：TQ317 文章編號(hào)：1009-2374（2016）30-0067-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.30.032

1 Aeromonashydrophila基本特性

Aeromonashydrophila屬于弧菌科（Vibrionaceae）Aeromonad屬，為革蘭氏陰性的兼性厭氧桿菌，直徑0.3～1.0μg/mL，長1.0～3.5μg/mL，具單一極鞭毛，有運(yùn)動(dòng)性。此菌為異營性（heterotrophic），能產(chǎn)生oxidase及catalase，并可利用某些碳水化合物產(chǎn)生酸或同時(shí)產(chǎn)氣（CO2、H2），亦會(huì)水解esculin。

2 傳統(tǒng)分析方法

2.1 利用培養(yǎng)基分離

早期Aeromonas菌屬的分離大多采用分離腸內(nèi)菌屬或海洋弧菌屬的培養(yǎng)基，由于A.hydrophila具有l(wèi)actose（+）及l(fā)actose（-）的菌株，而用以分離腸內(nèi)病原菌的培養(yǎng)基中的碳水化合物成分，常會(huì)抑制Aeromonas菌屬的生長。因此，一般用分離腸內(nèi)菌的培養(yǎng)基MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar等并不適用。近年來，許多學(xué)者分別針對(duì)食品或水等不同的來源而發(fā)展出適用的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基中皆添加ampicillin來抑制其他雜菌的生長，更有利于Aeromonas菌屬的回收。例如在臨床上，對(duì)于此菌的分離大多采用5%sheepbloodagar，另外添加1030g/mL的ampicillin，配合此菌產(chǎn)生β-溶血素的能力來區(qū)分，皆較以往分離腸內(nèi)菌的培養(yǎng)基佳。且由于A.hydrophila氧化酵素反應(yīng)常與培養(yǎng)基成分有關(guān)，而用sheepbloodagar并不會(huì)對(duì)此反應(yīng)造成干擾。對(duì)于食品中此菌的分離，同樣可以ampicillin（10g/mL）作為抑制劑，starch則是用以區(qū)分的受質(zhì)，當(dāng)菌落形成后，加入Lugolsiodinesolution，菌落為amylase（+）者，即為A.hydrophila。此方法已被廣泛應(yīng)用于食品中A.hydrophila的分離，然而SA無法區(qū)分A.hydrophila與A.caviae。

另外，Oxoid公司將XLD（xyloselysinedeoxycholate）修飾后發(fā)展出RyansAeromonasmediumbase，再添加5μg/mL ampicillin，專用以分離Aeromonas及Plesiomonas菌屬，前者為深綠色菌落，后者則為藍(lán)灰色菌落（OxoidproductcodesCM833）。以SA、SGAP（starchglutamateampicillinagar）及RAM（RyansAeromonasmedium）來比較食品中A.hydrophila的分離率，結(jié)果三種選擇性培養(yǎng)基皆有93%以上的分離率，并無顯著差異。

Tsai和Chen（1996）以三種選擇性培養(yǎng)基SA、Bloodampicillinagar（BA）及OxoidAeromonasagar（OA）分離水產(chǎn)品中A.hydrophila，結(jié)果以BA分離出此菌的比率最高，SA及OA所得的典型菌落，經(jīng)生化測(cè)試后，許多菌落為A.sobria或A.caviae，顯示此兩種選擇性培養(yǎng)基對(duì)A.hydrophila、A.caviae以及A.veronii辨識(shí)度較差，可能是因?yàn)镺A中的ampicillin濃度較低所致。

水中A.hydrophila的分離則大多采用，先將樣品增殖培養(yǎng)（enrichment）后，以膜過濾，再置于ADA上培養(yǎng)。而Holmes及Sartory（1993）以ADA、XAA、RAM及BIBA比較146個(gè)水樣中Aeromonasspp.的分離率，結(jié)果以ADA及RAM回收率較好。

2.2 利用生化特性鑒定

A.hydrophila的鑒定方法一般是參考BergeysManualofSystematicBacteriology進(jìn)行各種生化測(cè)試，例如oxidase、catalase、starchhydrolysis、fermentationofglucose、mannitol、fructose、galactose、dextrin及esculin水解等。然而傳統(tǒng)生化測(cè)試有其困難點(diǎn)，A.hydrophila培養(yǎng)在不同培養(yǎng)基，對(duì)相同生化測(cè)試，不一定有相同的反應(yīng)，且耗費(fèi)很多時(shí)間配制培養(yǎng)基，需要進(jìn)行繁復(fù)的測(cè)試，因此商業(yè)上發(fā)展了鑒定套組來加以確認(rèn)。于鑒定套組方面，可以通過比較API20E、APIRE及APINFT等套組，顯示API20E鑒定的正確率達(dá)100%，APIRE及APINFT分別只達(dá)77%及87%的正確率。于實(shí)際應(yīng)用時(shí)，API20E亦可準(zhǔn)確鑒定出牡蠣、臨床及環(huán)境的A.hydrophila分離株，但是由于許多環(huán)境分離株未列入API資料檔，因此以API20E鑒定環(huán)境分離株時(shí)，應(yīng)同時(shí)對(duì)一些重要生化反應(yīng)，再輔以傳統(tǒng)生化測(cè)試方法以

確認(rèn)。

而對(duì)于API20E、APINE及Microbact24NE做比較，可以發(fā)現(xiàn)API20E鑒定的正確率只達(dá)72.5%，而APINE及Microbact24NE的正確率則皆達(dá)97.5%。另外，也可以GNMicroplate（BIOLOG，Hayward，Calif）測(cè)試60株臨床分離株（A.hydrophila、A.sobria及A.caviae各20株）對(duì)于95種碳源的氧化能力，認(rèn)為此套組能有效地鑒定出臨床的Aeromonas分離株。在傳統(tǒng)鑒定中，利用選擇性培養(yǎng)基分離出可疑菌落，以生化測(cè)試確認(rèn)；而鑒定套組只能縮短生化測(cè)試的時(shí)間，仍需輔以傳統(tǒng)方法確認(rèn)。

3 快速分析方法

由于A.hydrophila的傳統(tǒng)分析方法，除了選擇性培養(yǎng)基多種選擇外，各種生化套組鑒定時(shí)仍需輔以傳統(tǒng)生化測(cè)試，耗時(shí)費(fèi)力，無法因應(yīng)工業(yè)界快速得知結(jié)果的要求。人們極欲發(fā)展此菌的核酸探針及免疫分析的快速分析方法。

3.1 核酸探針

A.hydrophila共含三個(gè)DNAhybridizationgroup，即HG1、HG2、HG3，由環(huán)境中分離的以HG3為主，病患檢體中分離的菌株，則以HG1為主。利用16SrRNA為引子，以PCR分析鑒定環(huán)境中的菌數(shù)與雜交的相關(guān)性，檢測(cè)67件樣品，顯示在海水（22/67）、溪水（3/67）、臨床檢體（0/67）的檢出率不高，且與其他菌株有交叉反應(yīng)。另外，探討由人的糞便分離Aeromonasspp.菌株的表現(xiàn)型與DNA的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)基因分類與表現(xiàn)型的鑒定有時(shí)檢測(cè)結(jié)果不一致，其建議當(dāng)表現(xiàn)型及一些生化測(cè)試不具特異性時(shí)，需輔以基因的測(cè)試。為了發(fā)展核酸探針以快速分析A.hydrophila，必須先尋找A.hydrophila所特有的基因。從水域中的A.hydrophila找到其腸毒素基因，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)A.hydrophila的腸毒素與霍亂毒素兩種基因的DNA核酸序列相似，因此不適合當(dāng)特異性的探針。

利用A.hydrophila溶血基因建立了長度為48個(gè)寡核酸的探針，并另外由霍亂弧菌毒素基因建立了長度為34個(gè)核酸（C1）及19個(gè)寡核酸（C2）的探針，其首先以A.hydrophila溶血基因探針，利用菌落雜交法，找出呈陽性反應(yīng)的A.hydrophila菌落，抽取其染色體DNA后，再用南方轉(zhuǎn)移，再分別以霍亂毒素基因片段C1、C2為核酸探針進(jìn)行DNA雜交法，發(fā)現(xiàn)部分菌株與霍亂弧菌毒素探針（C1）有陽性反應(yīng)，但對(duì)C2探針則為陰性反應(yīng)，顯示霍亂弧菌毒素基因及水域菌株的溶血素基因的核酸序列相似。因此目前利用A.hydrophila溶血基因片段所建立的核酸探針法尚無法克服偽陽性反應(yīng)的問題。利用randomlyamplifiedpolymorphicDNA（RAPD）技術(shù)分類7株A.hydrophila菌株，經(jīng)PCR產(chǎn)生DNA，以SmaⅠ限制產(chǎn)生指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)此7株菌在RAPD沒有一致性的片段，顯示其基因變化大。

3.2 免疫分析法

免疫分析法包含免疫沈淀法、免疫電泳法、免疫熒光法、放射性免疫分析法（RIA）和酵素免疫分析法（EIA），均已用于臨床及病原菌的抗原測(cè)定。放射性免疫分析法和酵素免疫分析法具有高敏感性。

4 結(jié)語

目前對(duì)A.hydrophila的分離與鑒定尚未標(biāo)準(zhǔn)化。早期Aeromonas菌屬的分離大多采用分離腸內(nèi)菌屬或海洋弧菌屬的培養(yǎng)基，然而如MacConkeyagar或eosinmethyleneblueagar中的碳水化合物會(huì)抑制部分A.hydrophila的生長，并不適用于分離。近年來，許多學(xué)者分別針對(duì)病人檢體、食品或水等不同來源的菌株而發(fā)展相關(guān)的培養(yǎng)基，且均利用ampicillin來抑制其他雜菌的生長。然而不論何種選擇性培養(yǎng)基，其上可疑菌落均必須經(jīng)過生化鑒定，方能確定為A.hydrophila。

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