高效液相色譜法測(cè)定雞肉中六種四環(huán)素的方法研究

徐少華

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東深圳 518005）

高效液相色譜法測(cè)定雞肉中六種四環(huán)素的方法研究

徐少華

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東深圳 518005）

建立高效液相色譜法測(cè)定雞肉中6種四環(huán)素的方法。優(yōu)化色譜條件，色譜柱為Agilent SB C18，150* 4.6 mm，配紫外熒光檢測(cè)器350 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣體積50 μL，流動(dòng)相0.01 mol·L-1草酸+乙腈，0到15 min的乙腈比例從5%～40%。通過研究對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)利用HLB和羧酸根陽(yáng)離子交換柱兩種固相萃取小柱可以充分去除雜質(zhì)干擾，分別選擇乙酸乙酯洗脫HLB柱，含15%乙腈的0.01 mol·L-1草酸溶液作為陽(yáng)離子交換柱的洗脫液。通過以上試驗(yàn)方法，可以同時(shí)測(cè)定雞肉中6種四環(huán)素的含量，并且結(jié)果具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，該方法可用于雞肉中四環(huán)素殘留的檢測(cè)。

高效液相色譜法；四環(huán)素；色譜條件；凈化

四環(huán)素類抗生素（TCs）是人類和動(dòng)物臨床上廣泛使用的廣譜抗生素。TCs作為廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及立克次氏體等均有較好的抑制作用[1-4]。TCs在動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟等組織中殘留[5-8]，能對(duì)食用人群的健康產(chǎn)生不良的影響甚至可以致病。因此，許多國(guó)家對(duì)TCs殘留進(jìn)行監(jiān)控。我國(guó)和歐盟對(duì)TCs的最高殘留限量規(guī)定，食用性動(dòng)物肌肉組織中TCs含量≤100 μg·kg-1。

目前，動(dòng)物源性食品中TCs等藥物殘留的檢測(cè)方法主要有微生物法、免疫分析法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中高效液相色譜法具有高效、快捷、靈敏度和檢出率高的優(yōu)點(diǎn)，且易推廣，是目前使用最廣泛的方法，但高效液相色譜法對(duì)樣品前處理要求較高，若樣品前處理不好，易出現(xiàn)雜峰，從而影響目標(biāo)物質(zhì)的測(cè)定[9-13]。液相色譜條件也同樣對(duì)多種目標(biāo)物質(zhì)峰的分離有極大影響。本文通過優(yōu)化前處理以及色譜條件，為同時(shí)測(cè)定6種四環(huán)素提供方法依據(jù)。

1 試驗(yàn)設(shè)備與材料

1.1 試驗(yàn)設(shè)備

高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器（Agilent 1260），分析天平，固相萃取真空裝置，pH計(jì)，超聲提取儀，sigma高速冷凍離型機(jī)，超純水器，水浴氮?dú)獯蹈蓛x，旋轉(zhuǎn)式振蕩器。

1.2 材料與試劑

市售雞肉，雙圈定量濾紙，濾膜（0.22 μm，水相）Oasis HLB固相萃取小柱（500 mg，6 mL），使用前用甲醇10 mL和水10 mL活化；羧酸根陽(yáng)離子交換柱5 mg，3 mL，使用前用乙酸乙酯活化。甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純）、草酸（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉。

TCs標(biāo)準(zhǔn)品：二甲胺四環(huán)素（MNC），土霉素（OTC），四環(huán)素（TC），去甲基金霉素（DMCT），金霉素（CTC），強(qiáng)力霉素（DC），純度均≥96%。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

流動(dòng)相梯度條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度條件

本試驗(yàn)研究了流動(dòng)相梯度條件，結(jié)果由表1可知，色譜柱為Agilent SB C18，150*4.6 mm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為50 uL；流動(dòng)相為15%乙腈的0.01 mol·L-1草酸溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的MNC、OTC、TC、DMCT、CTC、DC各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至100 mL，濃度相當(dāng)于100 μg·mL-1，儲(chǔ)備液在＜-18℃貯存于棕色瓶中，備用。

2.3 工作曲線的配置

準(zhǔn)確量取MNC、OTC、TC、DMCT、CTC、DC儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相定容至10 mL棕色容量瓶中配置成混標(biāo)，并逐級(jí)對(duì)混標(biāo)稀釋成10、20、50、100、200、400 ng·mL-1不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.4 測(cè)定步驟

2.4.1 提取

稱取均質(zhì)試樣4 g（精確到0.01），置于50 mL聚丙烯離心管中，分別用約0.1 mol·L-1EDTA-Mcllvainc緩沖溶液20 mL、10 mL冰水浴超聲提取兩次，每次渦旋混合1 min，超聲提取10 min，冷凍使提取液低于4℃，8 000 r·min-1冷凍離心5 min，合并上清液，混勻，8 000 r·min-1離心20 min（溫度＜4℃），用快速定量濾紙過濾，待凈化。

2.4.2 凈化

將上清液倒入Oasis HLB固相萃取柱，上清液以≤3 mL·min-1的流速通過固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5 mL去離子水和5 mL（甲醇1+水19）洗柱，棄去全部流出液。在65 kPa的負(fù)壓下，減壓抽干20 min，最后用10 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中。將上述洗脫液在減壓情況下以≤3 mL·min-1的流速通過羧酸型陽(yáng)離子交換柱，待洗脫液全部流出后，用5 mL甲醇洗柱，棄去全部流出液。在65 kPa負(fù)壓下，減壓抽干5 min，再用4 mL流動(dòng)相洗脫，收集洗脫液于5 mL樣品管中，定容至4 mL，供液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相改性劑的選擇

本試驗(yàn)分別以0.01 mol·L-1草酸、0.01 mol·L-1檸檬酸、和0.01 mol·L-1三氟乙酸為改性劑，分析了不同改性劑對(duì)四環(huán)素類藥物分離度和峰形的影響。結(jié)果表明，3種改性劑均能使6種四環(huán)素類藥物有效分離，以三氟乙酸為流動(dòng)相改性劑色譜峰保留時(shí)間較長(zhǎng)，峰型有些拖尾，檸檬酸比草酸的靈敏度要低一些，草酸為揮發(fā)性酸，從對(duì)色譜峰靈敏度和保留時(shí)間角度考慮，選擇草酸作為本試驗(yàn)流動(dòng)相改性劑。

3.1.2 流動(dòng)相梯度選擇

本試驗(yàn)中研究了有機(jī)相與水相的比例對(duì)6種TCs藥物分離效果的影響。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，有機(jī)相的比例越高，分析速度越快，響應(yīng)值越高，檢測(cè)靈敏度就越高；當(dāng)流動(dòng)相中不含甲醇時(shí)，分析速度快，檢測(cè)靈敏度高，分離度變差；當(dāng)流動(dòng)相中不含乙睛時(shí)，分析速度慢，檢測(cè)靈敏度低。當(dāng)用實(shí)際樣品進(jìn)行分析時(shí)，樣品基質(zhì)對(duì)被測(cè)物的干擾較大，按梯度洗脫時(shí)，干擾基本消除，分析時(shí)間縮短，靈敏度大大提高。

3.2 凈化條件的選擇

3.2.1 固相萃取小柱選擇

100ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過Oasis HLB固相萃取柱凈化色譜圖見圖1。100 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過Oasis HLB和羧酸根陽(yáng)離子交換柱凈化色譜圖見圖2。

圖1 100 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過Oasis HLB固相萃取柱凈化色譜圖

圖2 100 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過Oasis HLB和羧酸根陽(yáng)離子交換柱凈化色譜圖

對(duì)比了用OasisHLB單一固相萃取柱凈化和Oasis HLB、羧酸根陽(yáng)離子交換柱雙柱凈化效果。由圖1、圖2可知，通過實(shí)際樣品加標(biāo)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只用HLB柱的除雜效果差，雜質(zhì)干擾峰較多，出現(xiàn)重疊峰；經(jīng)過雙柱凈化，6種目標(biāo)物質(zhì)無干擾峰。故本試驗(yàn)選用雙柱凈化樣品。

本試驗(yàn)凈化過程中需要注意的是，洗脫Oasis HLB之前要盡量抽干，如果不能完全抽干，在乙酸乙酯洗脫過程中，HLB柱殘留水相會(huì)一同流出，導(dǎo)致洗脫液有分層現(xiàn)象，則在過羧酸根陽(yáng)離子交換柱時(shí)，只將上層的乙酸乙酯洗脫液層過柱。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果將帶有水相的洗脫液一起過羧酸根陽(yáng)離子交換柱，則目標(biāo)物質(zhì)將跟隨乙酸乙酯混合液一同流失，不被保留于固相萃取小柱上。

3.3 方法的線性與檢出限

四環(huán)素類藥物回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

在上述色譜條件下，6種TCS相關(guān)系數(shù)r≥0.999，按3倍儀器信噪比計(jì)算檢出限。

3.4 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

加標(biāo)回收率及精密度見表3。取空白雞肉樣品18份，分3組進(jìn)行50、100和200 μg·kg-1添加水平按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。由表3可知，本方法的3種濃度試驗(yàn)回收率為71.8%～ 103.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.30%～7.81%，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

表2 四環(huán)素類藥物回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表3 加標(biāo)回收率及精密度

4 結(jié)論

試驗(yàn)建立了高效液相色法同時(shí)測(cè)定雞肉組織中二甲胺四環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素6種四環(huán)素族抗生素殘留量的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，以0.01 mol·L-1草酸與乙腈在15 min內(nèi)梯度洗脫可使目標(biāo)峰完全分離，峰形良好。通過對(duì)比前處理凈化步驟，發(fā)現(xiàn)Oasis HLB和羧酸根陽(yáng)離子交換柱可以使樣品達(dá)到很好的除雜效果，避免雜質(zhì)峰的影響。經(jīng)過加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該方法完全可以達(dá)到同時(shí)測(cè)定6種四環(huán)素的效果。

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Research on Determination of Six Kinds of Tetracycline in Chicken by HPLC

XU Shaohua

（Shenzhen Agricultural Product Quality Safety Inspection Testing Center,Shenzhen 518005,Guangdong China）

To establish a HPLC method with the determination of six kinds of tetracycline in chicken,chromatographic column for Agilent SB C18 150*4.6 mm,ultraviolet fluorescence detector 350 nm,column temperature 25℃,sample size 50 μL and mobile phase was 0.01 mol·L-1oxalic acid+acetonitrile.Acetonitrile proportion increased from 5%to 40%in 15 minutes.Through the contrast experiment,found the use of HLB and carboxylic acid pillar of cation exchange,two kinds of solid phase extraction small column could fully remove impurity interference and chose ethyl acetate elution HLB respectively,15%acetonitrile 0.01 mol·L-1oxalic acid solution as the eluent cation exchange column.Through the above experiment method,could simultaneously determine the content of six kinds of tetracycline in chicken,and the results had good precision and accuracy.This method could be used for tetracycline residue inchicken.

HPLC;tetracycline;chromatographic conditions;purification

S831；S816.7

A

1001-0084（2016）11-0006-05

2016-08-18

徐少華（1991-），男，浙江衢州人，助理工程師，主要從事獸藥殘留檢測(cè)工作。