“肺主呼吸”對(duì)“通調(diào)水道”影響的實(shí)驗(yàn)觀察

王振亦 孫 燕 張淑靜 高譽(yù)珊 倪 磊 劉曉蕾 張金超 魏雅楠 趙朋娜 康鵬飛 邱 巖 楊佳敏 李宇航

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

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“肺主呼吸”對(duì)“通調(diào)水道”影響的實(shí)驗(yàn)觀察

王振亦 孫 燕 張淑靜 高譽(yù)珊 倪 磊 劉曉蕾 張金超 魏雅楠 趙朋娜 康鵬飛 邱 巖 楊佳敏 李宇航

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

目的:觀察呼吸功能改變與尿量變化之間的相關(guān)性,探討觀察“肺主呼吸”對(duì)“通調(diào)水道”的影響。方法:以尿液量變化為主要指標(biāo),觀察哮喘模型小鼠呼吸功能改變、慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases,COPD)模型呼吸大鼠功能改變及正壓擴(kuò)肺家兔肺通氣活動(dòng)改變對(duì)“通調(diào)水道”的影響。測(cè)量各動(dòng)物特定時(shí)段的產(chǎn)尿量,觀察模型組動(dòng)物尿量是否較對(duì)照組有所改變。結(jié)果:3個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M動(dòng)物尿量均較對(duì)照組減少。1)哮喘模型小鼠5 h總尿量較對(duì)照組減少(P<0.05);2)COPD模型大鼠在6 h,12 h,18 h和24 h各時(shí)段的總尿量均較對(duì)照組減少(P<0.05);3)正壓擴(kuò)肺家兔尿量較自身平靜呼吸時(shí)10 min內(nèi)尿滴數(shù)減少(P<0.05),且正壓擴(kuò)肺家兔正壓擴(kuò)肺干預(yù)后10 min內(nèi)尿滴數(shù)較對(duì)照組減少(P<0.05)。結(jié)論:獲得了“肺主呼吸”對(duì)“通調(diào)水道”的影響實(shí)驗(yàn)依據(jù),為進(jìn)一步深入探討“肺主通調(diào)水道”相關(guān)分子信號(hào)的調(diào)控途徑,揭示其現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

肺主呼吸;呼吸功能;尿量;通調(diào)水道

“肺主行水”是中醫(yī)經(jīng)典的藏象理論之一。現(xiàn)在中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論將“肺主通調(diào)水道”這一生理功能概括為“肺主行水”,指的是肺具有疏通和調(diào)節(jié)水液運(yùn)行的通道,從而推動(dòng)水液輸布和排泄的作用[1]。已有臨床研究表明在呼吸功能的改變的情況下,人體的尿液量也會(huì)發(fā)生變化,但其內(nèi)在機(jī)制尚未明確[2-3]。為了探討“肺主呼吸”與“通調(diào)水道”的相關(guān)性,本文以尿液量變化為主要指標(biāo),觀察小鼠哮喘模型呼吸功能改變、大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型呼吸功能改變及家兔正壓擴(kuò)肺模型肺通氣活動(dòng)改變對(duì)“通調(diào)水道”的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 1)清潔級(jí)健康BALB/C小鼠,雌性,21只,鼠齡6～8周,體重(15±5) g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,合格證號(hào):SCXK(京)2012-0001。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,對(duì)照組15只,模型組15只。2)清潔級(jí)健康Wistar大鼠,雄性,30只,鼠齡4～6周,體重(200±50) g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,合格證號(hào):SCXK(京)2012-0001。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,對(duì)照組8只,模型組8只。3)清潔級(jí)健康新西蘭家兔,雄性,16只,兔齡2個(gè)月齡,體重(2.0±0.5)kg，購(gòu)于北京興隆養(yǎng)殖場(chǎng),合格證號(hào):SCXK(京)2011-0006。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,對(duì)照組8只,模型組8只。動(dòng)物置于清潔柜中,喂以普通飼料,自由飲水,實(shí)驗(yàn)室溫度保持在(23±1) ℃,濕度(45±5)%左右,標(biāo)準(zhǔn)的12 h晝夜交替周期(每日早上8：00開(kāi)燈)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,動(dòng)物至少適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院倡導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷、使用指導(dǎo)原則和以減少、替代和優(yōu)化為核心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則。

1.2 藥物與試劑 高純度卵清蛋白(OVA)(Sigma公司,批號(hào):SLBD2312V);氫氧化鋁凝膠(Thermo公司,批號(hào):OG189802);0.1 mol/L磷酸緩沖液;脂多糖(LPS,Sigma公司);大前門(mén)牌香煙(上海煙草公司,烤煙型,焦油量12 mg,煙氣煙堿量0.9 mg,煙氣一氧化碳量14 mg);4%戊巴比妥鈉溶液;葡萄糖(BeijingBiodee BiotechnologyCo.,Ltd);0.9%氯化鈉(石家莊四藥有限公司,批號(hào):1506303202);氨基甲酸乙酯;(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20140422);肝素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20120919)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 402B醫(yī)用超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司);動(dòng)物霧化箱(20 cm×30 cm×40 cm),自制;動(dòng)物熏吸箱(60 cm×50 cm×40 cm),自制;MP5002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);高精度移液器(Eppendorf);大小鼠代謝籠(由北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供);HX-300s動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司);BL420生物信號(hào)采集系統(tǒng),呼吸換能器,血壓換能器,尿滴換能器等(由北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.4 模型制備

1.4.1 小鼠哮喘模型建立 參考文獻(xiàn)[4-5]用復(fù)合形式的OVA致敏和激發(fā)建立支氣管哮喘模型組:于第1、13天給小鼠腹腔注射OVA(Grade II,Sigrna公司)100 μg和氫氧化鋁凝膠(Pierce公司)1.5 mg混合液0.2 mL致敏。第15天,將小鼠每5只1組置于20 cm×30 cm×40 cm有機(jī)玻璃箱內(nèi);用402B醫(yī)用超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)以1%(w/v PBS)OVA進(jìn)行霧化吸入激發(fā),將小鼠暴露在OVA氣霧中30 min,2次/d,間隔4 h,持續(xù)7 d。對(duì)照組則以蒸餾水腹腔注射,連續(xù)7 d。

1.4.2 COPD大鼠模型建立 參文獻(xiàn)[6]采用氣管注脂多糖加熏香煙方法復(fù)制COPD大鼠模型:在第1天、14天,用1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥位固定大鼠,暴露聲門(mén),將18號(hào)靜脈留置針快速插入氣管,拔出針芯,注入200 μL LPS溶液(1 mg/mL),然后將大鼠直立,使LPS溶液充分浸潤(rùn)于兩肺中。第2～28天(第14天除外)將大鼠置于60 cm×50 cm×40 cm的動(dòng)物熏煙箱內(nèi),注入5根大前門(mén)牌過(guò)濾嘴香煙煙霧,濃度約5%,每天上、下午熏煙各1次,1 h/次。對(duì)照組于第1天和第14天氣管注入200 μL 0.9%生理鹽水,第2～28天不熏煙(第14天除外),自由呼吸。

1.4.3 家兔呼吸功能改變模型建立 參文獻(xiàn)[7]創(chuàng)建的正壓擴(kuò)肺方法,制備家兔呼吸功能改變動(dòng)物模型。從耳緣靜脈注射20%的烏拉坦溶液(5 mL/kg)麻醉家兔。待家兔完全麻醉后切開(kāi)家兔頸部皮膚,進(jìn)行氣管插管,尿道插管,同時(shí)靜脈滴注含5%葡萄糖的生理鹽水(30滴/min)。打開(kāi)Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng),記錄家兔平靜呼吸狀態(tài)下10 min內(nèi)的尿滴數(shù)。模型組家兔連接呼吸機(jī)進(jìn)行擴(kuò)肺干預(yù)(呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為:潮氣量20 mL/kg,呼吸比1∶2,呼吸頻率10次/min),記錄家兔10 min內(nèi)的尿滴數(shù)。對(duì)照組家兔同模型組家兔一樣進(jìn)行麻醉、氣管插管、尿道插管,但不進(jìn)行呼吸機(jī)擴(kuò)肺的呼吸干預(yù)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 小鼠尿量檢測(cè) 末次霧化后,動(dòng)物禁食不禁水12 h,于干預(yù)造模第22天,將已稱(chēng)重的濾紙固定于代謝籠底部,輕壓小鼠下腹部以排盡余尿,每只小鼠腹腔注射生理鹽水1 mL作為水負(fù)荷。每1 h用電子天平稱(chēng)量并記錄濾紙的增重量并更換新濾紙,連續(xù)觀察5 h[6]。采用代謝籠檢測(cè)小鼠尿量,隨機(jī)按每籠2～3只小鼠分組,每組分為6只籠,取每只代謝籠的平均尿量做統(tǒng)計(jì)。

1.5.2 大鼠尿量檢測(cè) 于造模第28天,參文獻(xiàn)[8]的尿量檢測(cè)方法:給予20 mL/kg蒸餾水水負(fù)荷,30 min后逐一輕壓大鼠下腹部,排盡余尿,立即置入代謝籠,連續(xù)觀察記錄24 h尿量。

1.5.3 家兔尿量檢測(cè) 運(yùn)用BL420生物信號(hào)采集系統(tǒng),記錄不同呼吸狀態(tài)下10 min內(nèi)的尿滴數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)照組與模型組尿量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行讓統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,家兔正壓擴(kuò)肺干預(yù)前后的尿滴數(shù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)志。

2 結(jié)果

2.1 小鼠連續(xù)5 h尿量測(cè)定 如表1所示,與正常組相比,哮喘模型組小鼠5 h總尿量減少;在第1 h,模型組尿量明顯高于正常組(P<0.01);在第2～5 h,與正常組相比模型組尿量有降低趨勢(shì)。

表1 對(duì)照組及模型組小鼠尿量的差異分析(±s)

表1 對(duì)照組及模型組小鼠尿量的差異分析(±s)

注:*與對(duì)照組比較P<0.01;△與對(duì)照組比較P<0.05。

分組對(duì)照組模型組只數(shù)665h總尿量0.670±0.1830.489±0.059*1h0.056±0.0480.155±0.097△2h0.192±0.0830.133±0.0543h0.129±0.0750.059±0.0524h0.183±0.1530.053±0.0285h0.109±0.0450.088±0.073

2.2 大鼠連續(xù)24 h尿量影響 如表2所示,COPD模型大鼠較對(duì)照組大鼠各個(gè)在6 h,12 h,18 h和24 h內(nèi)的總尿量均減少,兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 對(duì)照組和模型組大鼠24 h尿量的差異分析(±s)

表2 對(duì)照組和模型組大鼠24 h尿量的差異分析(±s)

注:*與對(duì)照組比較,P<0.05。

分組對(duì)照組模型組只數(shù)666h總尿量16.93±4.1812.71±3.34*12h總尿量26.91±4.5518.28±3.58*18h總尿量34.95±4.8221.35±3.0*24h總尿量40.68±5.6323.75±2.79*

2.3 家兔尿滴數(shù)測(cè)定 如表3所示,模型組家兔正壓擴(kuò)肺后,尿滴數(shù)較平靜呼吸顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);如表4所示,對(duì)照組家兔與模型組家兔平靜呼吸時(shí),兩者尿滴數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);如表5所示,模型組家兔正壓擴(kuò)肺時(shí)較同階段對(duì)照組家兔,尿滴數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 模型組家兔平靜呼吸和正壓擴(kuò)肺時(shí)的尿滴數(shù)(±s)

表3 模型組家兔平靜呼吸和正壓擴(kuò)肺時(shí)的尿滴數(shù)(±s)

注:*與平靜呼吸比較,P<0.05。

模型組平靜呼吸正壓擴(kuò)肺No.11095No.27810No.315595No.4364107No.517849No.610585No.77732No.8114199mean±sd47.5±94.1660.25±41.42*

表4 對(duì)照組與模型組家兔平靜呼吸時(shí)的尿滴數(shù)(±s)

表4 對(duì)照組與模型組家兔平靜呼吸時(shí)的尿滴數(shù)(±s)

注:*與對(duì)照組比較,P>0.05。

組別對(duì)照組模型組No.1143109No.215578No.394155No.457364No.5111178No.6134105No.714277No.81171141mean±sd119.43±31.9847.5±94.16

表5 模型組家正壓擴(kuò)肺和對(duì)照組家兔同階段平靜呼吸時(shí)的尿滴數(shù)(±s)

表5 模型組家正壓擴(kuò)肺和對(duì)照組家兔同階段平靜呼吸時(shí)的尿滴數(shù)(±s)

注:*與對(duì)照組比較,P<0.05。

組別對(duì)照組模型組No.11195No.211010No.36395No.451107No.519249No.618985No.716032No.89599mean±sd122.375±53.7760.25±41.42*

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,肺的主要生理功能包括:主氣,主宣降,主行水,朝百脈,主治節(jié)等。其中“肺主氣”是肺的最基本功能,又包括主呼吸之氣和主一身之氣2個(gè)方面。肺主一身之氣的功能,主要取決于肺的呼吸功能。

肺主行水,是指肺氣具有推動(dòng)和調(diào)節(jié)全身水液的輸布和排泄的作用。所謂“肺主通調(diào)水道”,即是指肺主行水的功能。由于肺位于人體的上部,主行水而通調(diào)水道,其宣發(fā)肅降作用可疏通和調(diào)節(jié)水液代謝。故清·汪昂《醫(yī)方集解》稱(chēng)“肺為水之上源”,對(duì)人體的水液代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。如肺的宣發(fā)或肅降功能失常,不僅影響肺的呼吸功能,還會(huì)影響水道的通調(diào)。

“肺主通調(diào)水道”與西醫(yī)生理相同,都包含了呼吸、汗液和尿液3方面的水液代謝行為。其中,經(jīng)腎臟產(chǎn)生的尿液量多,便于觀察和收集。因此課題組通過(guò)復(fù)制了哮喘,慢性阻塞性肺疾病這2種常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)的疾病的模型以及建立了單純的家兔呼吸功能改變模型,重點(diǎn)觀察是否呼吸功能的改變對(duì)尿量有變化。BALB/c小鼠易對(duì)OVA(卵白蛋白)和花粉致敏產(chǎn)生AHR和明顯lgE超敏反應(yīng)[9],而且有研究發(fā)現(xiàn)雌性小鼠比雄性小鼠能產(chǎn)生更顯著的過(guò)敏性氣道炎性反應(yīng)[10]。在復(fù)制哮喘模型時(shí),課題組選用了BALB/c雌性小鼠,腹腔注射OVA和氫氧化鋁凝膠,并以1%的OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā)的方法復(fù)制過(guò)敏性哮喘模型。在給小鼠測(cè)量尿量中發(fā)現(xiàn),由于小鼠的體積原因,1只小鼠排尿量很少,所以每只代謝籠供2～3只小鼠同時(shí)檢測(cè)尿量,每組分為6只代謝籠,取每只代謝籠的平均尿量做統(tǒng)計(jì)。COPD動(dòng)物模型的制備方法有很多種,目前最常見(jiàn)的COPD模型復(fù)制方法有被動(dòng)吸煙法、蛋白酶誘導(dǎo)的COPD動(dòng)物模型法和化學(xué)藥物誘導(dǎo)的動(dòng)物模型法等,其中LPS聯(lián)合煙熏的造模方法操作簡(jiǎn)單,可明顯縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,而且更符合COPD發(fā)生過(guò)程中感染和吸煙的兩重要誘因。

本課題組為了觀察短時(shí)間內(nèi)肺功能改變地機(jī)體尿量變化情況,采用了家兔正壓擴(kuò)肺的方法,并對(duì)前人的方法進(jìn)一步改良。由于用人工的方法進(jìn)行正壓擴(kuò)肺,擴(kuò)肺時(shí)間和力度不易控制,課題組采用呼吸機(jī),能夠均勻的改變家兔呼吸節(jié)律和正壓擴(kuò)肺的時(shí)間,更具有可控性。而且采用Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng),更能全程監(jiān)控家兔在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中諸如呼吸、血壓、尿滴等各項(xiàng)生理指標(biāo),便于測(cè)量、統(tǒng)計(jì)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,由于手術(shù)出血、蒸發(fā)等多方面因素,需加大補(bǔ)液量,過(guò)少的補(bǔ)液量不利于家兔產(chǎn)生尿液,30滴/min的補(bǔ)液量是觀察家兔肺功能改變與尿液量變化的一個(gè)合適值。

國(guó)外已有多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)呼吸功能改變可以引起尿量的變化[11-12],但是關(guān)于呼吸功能與尿量變化相關(guān)性的內(nèi)在機(jī)制卻迄今還無(wú)定論。有研究者認(rèn)為這可能是機(jī)體內(nèi)抗利尿激素[13]、鈉尿肽[14]等激素單方面變化導(dǎo)致的,也有研究者認(rèn)為這可能是交感-血管緊張素系統(tǒng)激活[15]或是血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的再調(diào)整[16]等多方面因素共同作用的結(jié)果。課題組設(shè)計(jì)3個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),首先,以尿液量變化為主要指標(biāo),觀察小鼠哮喘模型呼吸功能改變、大鼠COPD模型呼吸功能改變及家兔正壓擴(kuò)肺模型肺通氣活動(dòng)改變對(duì)“通調(diào)水道”的影響。為進(jìn)一步探討“肺主通調(diào)水道”相關(guān)分子信號(hào)的調(diào)控途徑,揭示其現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。提示3種不同方式的肺呼吸功能的改變均可引起尿量的減少。

綜上所述,肺的呼吸功能發(fā)生改變,肺主通調(diào)水道的功能也會(huì)隨之改變。但是肺呼吸功能改變?nèi)绾斡绊懙侥I的水液代謝,“肺主通調(diào)水道”的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制有待深入研究。課題組將從肺源性腎調(diào)控活性物質(zhì)等角度,探討“肺主通調(diào)水道”的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制,提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2016-01-28收稿 責(zé)任編輯：王明)

The Experimental Observation of effect of “Lung Governing Respiration” on “Regulating Waterway”

Wang Zhenyi, Sun Yan, Zhang Shujing, Gao Yushan, Ni Lei, Liu Xiaolei, Zhang Jinchao, Wei Yanan,Zhao Pengna, Kang Pengfei, Qiu Yan, Yang Jiamin, Li Yuhang

(1CollegeofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2modernclassicalprescriptionapplicationkeyscientificproblemsinbasicresearchandinnovationteam,BeijingUniversityofChinesemedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the correlation between respiratory function and urine volume change and to explore the influence of “l(fā)ung governing respiration” on “regulating waterway”. Methods:The effects of changes in urine volume, as the main index, respiratory function changes of asthma mice model and chronic obstructive lung disease (COPD) model and positive pressure expanding lung in rabbit pulmonary ventilatory activity changes on “regulating waterway” were observed. Urine volume of each animal was measured set for a specific time period and urine volume of model groups was compared with that of the control group. Results:The urine volumes of three experimental animal models were lower than those in the control group. 1) Five-hour total urine volume of asthma mice model of was less than that of the control group (P<0.05). 2) Total volume urine of COPD rat model at 6 h, 12 h, 18 h and 24 h separately were higher than those of the control group (P<0.05). 3) Urine drop number of positive pressure lung-expanding rabbits reduced compared to that during their 10 min normal breathing (P<0.05) and the one after 10 min expending was also decreased compared with that of the control group (P<0.05). Conclusion:The experimental basis of the effect of “l(fā)ung governing respiration” on “regulating waterway” was obtained to further explore the related molecular signaling pathways, providing foundation for modern biological mechanism.

Lung governing respiration; Respiratory function; Urine volume; Regulating waterways

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):81373503)

王振亦(1989.10—),男,2013級(jí)碩士研究生,研究方向:中醫(yī)辨證論治規(guī)律研究,E-mail:wangzhenyi109@163.com

李宇航(1960.08—),男,醫(yī)學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向:中醫(yī)辨證論治規(guī)律研究,Tel:(010)64287503,E-mail:liyuhang@bucm.edu.cn

R223.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.033