半滑舌鰨鰓黏液免疫相關(guān)酶活性對(duì)黃芪多糖的免疫應(yīng)答

劉金海，羅小麗，管 健，黃 輝，陳 恒

( 1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.集美大學(xué) 水生生物技術(shù)研究所，福建 廈門 361021； 3.鰻魚現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021 )

半滑舌鰨鰓黏液免疫相關(guān)酶活性對(duì)黃芪多糖的免疫應(yīng)答

劉金海1,2,3，羅小麗1，管 健1，黃 輝1，陳 恒1

( 1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.集美大學(xué) 水生生物技術(shù)研究所，福建 廈門 361021； 3.鰻魚現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021 )

在水溫25 ℃下，給體質(zhì)量(5.8±1.5) g的半滑舌鰨投喂在基礎(chǔ)飼料中添加0、300、600、900、1200、1500 mg/kg 和 1800 mg/kg黃芪多糖的飼料后，每隔18 d檢測(cè)半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，以檢測(cè)半滑舌鰨鰓黏液對(duì)黃芪多糖的免疫應(yīng)答及較佳劑量。90 d的免疫結(jié)果顯示，半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶和堿性磷酸酶活性先增強(qiáng)后降低；半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性對(duì)低劑量(300～600 mg/kg)和中高劑量(1200～1800 mg/kg)黃芪多糖的免疫應(yīng)答，隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，分別呈增強(qiáng)及先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，中低劑量(600～900 mg/kg)黃芪多糖組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均極顯著高于對(duì)照組(P< 0.01)。從成本、高非特異免疫活性的角度看，半滑舌鰨配合餌料中黃芪多糖較佳添加劑量為600 mg/kg。

黃芪多糖；溶菌酶；過氧化物酶；堿性磷酸酶；酸性磷酸酶

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)主要分布于我國(guó)的黃、渤海海域[1-2]，生長(zhǎng)快、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，為名貴暖溫性底棲大型海水養(yǎng)殖魚類[3-4]。近年來，隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模化和集約化不斷提高，養(yǎng)殖病害日益嚴(yán)重，采用抗生素和其他化學(xué)藥物來控制時(shí)，濫用和誤用漁藥會(huì)污染和惡化環(huán)境，威脅了人類的健康和安全。尋求無公害漁藥和新型免疫增強(qiáng)劑已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究熱點(diǎn)。中草藥為“綠色漁藥”，具有來源廣泛、價(jià)廉效優(yōu)、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。黃芪多糖是從來源豐富的黃芪根部分離出的多糖組分，具有廣泛的免疫增強(qiáng)和抗病毒作用，可作為一種新型的免疫增強(qiáng)劑，已在畜禽中廣泛應(yīng)用[5]，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用還較少。本試驗(yàn)在半滑舌鰨基礎(chǔ)餌料中分別添加6個(gè)不同水平的黃芪多糖，分析了其鰓黏液中溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，探討了黃芪多糖對(duì)半滑舌鰨鰓黏液免疫力的作用效果，為黃芪多糖在半滑舌鰨養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

半滑舌鰨體質(zhì)量(5.8±1.5) g，來源于福建省東山縣水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

采用單因素6水平3重復(fù)的試驗(yàn)方法。第1組為對(duì)照組，其他6組為試驗(yàn)組，各試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾魚。養(yǎng)殖于循環(huán)水過濾系統(tǒng)控制的養(yǎng)殖桶中，每桶容積為1.14 m3，控制養(yǎng)殖水體約1 m3，養(yǎng)殖密度為15尾魚/m3，鹽度為28±1。使用加熱棒控制水體溫度為(25±1) ℃，溶解氧>5 mg/L。暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)餌料；免疫試驗(yàn)期間，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)餌料，試驗(yàn)組投喂免疫餌料。每日于18:00和22:00投喂，1 h后吸掉殘餌。

基礎(chǔ)飼料配方見表1。先將魚粉、沙蠶粉、豆粉、淀粉、礦物鹽、酵母粉和預(yù)混料等粉狀成分按所需用量混合均勻，再將攪碎的牡蠣肉、魚油與粉狀料混勻，制粒備用。在基礎(chǔ)餌料中，添加不同劑量(300、600、900、1200、1500 mg/kg和1800 mg/kg)的黃芪多糖，配制成6種試驗(yàn)飼料。免疫試驗(yàn)后，每隔18 d檢測(cè)1次，半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性，試驗(yàn)周期為90 d，共測(cè)5次。

試驗(yàn)飼料配方見表2。將基礎(chǔ)飼料制成粉狀后，與黃芪多糖及面粉混勻，之后將血紅蟲、雞蛋和水用豆?jié){機(jī)打碎混勻，最后將上述粉料和液料混合均勻，至飼料用手揉起可成團(tuán)狀且不撒為宜。用制粒機(jī)將調(diào)和好的試驗(yàn)飼料制成2號(hào)顆粒，于烘箱中40 ℃烘干備用。

表1 試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料配方(每100 g含量)

表2 試驗(yàn)飼料的配方(每100 g含量)

注：對(duì)照組投喂基礎(chǔ)餌料，1～6組投喂試驗(yàn)飼料.

1.3 鰓黏液的采集方法

將魚鰓取出，用清洗干凈并消毒后的干紗布將其上的水及血吸干，之后將其置入10 mL玻璃離心管中加入5 mL蒸餾水，超聲震蕩20 min，取出魚鰓，保留含有黏液的溶液備用。

1.4 鰓黏液免疫相關(guān)酶活性的測(cè)定

1.4.1 溶菌酶活性的測(cè)定

溶菌酶活性參照劉金海等[6]方法測(cè)定。把一支CGMCC編號(hào)為1.0634的溶壁微球菌凍干粉從冰箱中取出并消毒。用移液槍吸取0.3～0.5 mL適宜的液體培養(yǎng)基滴入安瓿管中，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸濁液，吸取全部菌體懸濁液，接種于3支試管斜面培養(yǎng)基上，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再以活化細(xì)菌為菌種，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以后每3 d重新接種一次，確保菌種處于增長(zhǎng)期狀態(tài)，試驗(yàn)前24 h，再培養(yǎng)試用菌。

溶壁微球菌培養(yǎng)使用002營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基。

1.4.2 過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的測(cè)定

3種酶活性參照南京建成生物技術(shù)研究所提供的試劑盒和方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性對(duì)黃芪多糖的免疫應(yīng)答

隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性呈先增后減的變化趨勢(shì)(表3)。18～72 d，試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶的活性均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，添加黃芪多糖300～900 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，添加黃芪多糖1500～1800 mg/kg試驗(yàn)組魚鰓黏液溶菌酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，添加黃芪多糖1200 mg/kg試驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性隨黃芪多糖添加劑量增高，較早達(dá)到較高水平，之后便逐漸下降。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),600 mg/kg試驗(yàn)組的作用效果最好。

2.2 半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性對(duì)黃芪多糖的免疫應(yīng)答

隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性呈先增后減的變化趨勢(shì)，18 d后，半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性均極顯著或顯著高于對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)(表4)。試驗(yàn)中半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性隨黃芪多糖添加劑量增高，較早達(dá)到較高水平，之后便逐漸下降。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性均極顯著或顯著高于對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)，尤以添加黃芪多糖600 mg/kg試驗(yàn)組的作用效果最好。

表3 試驗(yàn)不同時(shí)間各組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性 IU

注：同列中2個(gè)小寫字母相同的平均值間差異不顯著，1個(gè)不同差異顯著，2個(gè)都不同差異極顯著。同行中2個(gè)大寫字母相同的平均值間差異不顯著，1個(gè)不同差異顯著，2個(gè)都不同差異極顯著.下同.

表4 試驗(yàn)不同時(shí)間各組半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性 IU

2.3 半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性對(duì)黃芪多糖的免疫應(yīng)答

除300 mg/kg試驗(yàn)組外，各試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性，隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈先增后減的變化趨勢(shì)；隨黃芪多糖添加劑量增高，半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性較早達(dá)到較高水平，之后便逐漸下降。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，300～1500 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中，尤以600 mg/kg試驗(yàn)組作用效果較好，1800 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

2.4 半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性對(duì)黃芪多糖的免疫應(yīng)答

300～600 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，36 d后極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；其余各組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性，隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先增后減趨勢(shì)(表6)。試驗(yàn)中半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性隨黃芪多糖添加劑量增高，較早達(dá)到較高水平，隨后逐漸降低。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；尤以900 mg/kg試驗(yàn)組作用效果較好。

表5 不同試驗(yàn)時(shí)間各組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性 IU

表6 不同試驗(yàn)時(shí)間各組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性 IU

3 討 論

3.1 黃芪多糖對(duì)半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性的影響

溶菌酶是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，是動(dòng)物機(jī)體許多組織重要的非特異性免疫因子和衡量非特異性免疫力的重要指標(biāo)。李義等[7]在基礎(chǔ)飼料中添加黃芪、黨參、大黃等中草藥制成的藥餌，顯著提了羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)血細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活力及酚氧化酶活力。袁呂江等[8]發(fā)現(xiàn)，魚腥草素同系物能夠提高小鼠血清溶菌酶活力，且隨濃度增加增幅加大；體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度的魚腥草素同系物可以明顯提高溶菌酶的活性，隨添加劑量的增加而抑制溶菌酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，600 mg/kg試驗(yàn)組和900 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性均在54 d時(shí)達(dá)最大值，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，之后雖降低，但仍極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，黃芪多糖對(duì)半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶活性的影響表現(xiàn)為300～900 mg/kg試驗(yàn)組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，1200 mg/kg試驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，1500～1800 mg/kg試驗(yàn)組則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。這與李義等[7-8]的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3.2 黃芪多糖對(duì)半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶普遍存在于真核生物的各類細(xì)胞中，與生物的非特異免疫功能水平有一定程度的關(guān)聯(lián)。趙娜等[9]發(fā)現(xiàn)，牙鲆(Paralichthysolivaceus)經(jīng)海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)3種免疫原免疫42 d后，血清中過氧化物酶活力先升高，第28 d起開始下降。顧華杰等[10]研究表明，灰樹花多糖使吉富羅非魚(GIFT,Oreochromisniloticus)血清和肝臟中過氧化物酶活性顯著提高，且表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，其促進(jìn)作用隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱。本研究與趙娜等[9-10]的研究結(jié)果相一致，即半滑舌鰨鰓黏液過氧化物酶活性先升高后逐漸降低，但各試驗(yàn)組過氧化物酶活性均顯著或極顯著高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。

3.3 黃芪多糖對(duì)半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性的影響

堿性磷酸酶廣泛分布于人體及動(dòng)物體的肝臟、骨骼、腸、腎等組織，經(jīng)肝臟向膽外排出。這種酶與人及動(dòng)物的免疫有關(guān)。王維新[11]對(duì)仿刺參(Apostichopusjaponicus)內(nèi)臟組織的免疫酶活性進(jìn)行了24 d的研究表明，仿刺參內(nèi)臟組織堿性磷酸酶活性在第14 d時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸降低。松浦鏡鯉(Cyprinusspecularis)幼魚血清堿性磷酸酶活性隨飼料中維生素D3添加量的增加而先升后降，飼料中維生素D3達(dá)800 IU/kg時(shí)，堿性磷酸酶活性最高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性隨試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢(shì)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，除1800 mg/kg組外，各試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。但黃芪多糖添加劑量越高，半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶活性達(dá)到最大值的時(shí)間越短，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性磷酸酶活性變化與黃芪多糖添加劑量無明顯相關(guān)。

3.4 黃芪多糖對(duì)半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶主要存在于動(dòng)物的巨噬細(xì)胞，定位于溶酶體內(nèi)，是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機(jī)磷酸的水解酶。水產(chǎn)動(dòng)物酸性磷酸酶的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能及催化機(jī)理已作了大量的研究[13]。如草魚(Ctenopharyngodonidellus)血清酸性磷酸酶活性隨飼料中牛膝多糖添加劑量的增加而增加，至0.20%后，則呈緩慢下降[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低劑量黃芪多糖(300～600 mg/kg)作用下，半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增強(qiáng)；在中高劑量黃芪多糖(900～1200 mg/kg、1500～1800 mg/kg)作用下，則呈先增后減的變化趨勢(shì)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。這與王紅權(quán)等[14]研究高劑量的牛膝多糖使草魚血清酸性磷酸酶活性下降但不抑制其活性的結(jié)果相一致。

4 小 結(jié)

(1)低劑量的黃芪多糖使半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性逐漸增強(qiáng)，對(duì)溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶活性具有先增強(qiáng)后抑制的作用；中高劑量的黃芪多糖對(duì)溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性均具有先增強(qiáng)后抑制的作用。

(2)半滑舌鰨鰓黏液中溶菌酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性對(duì)黃芪多糖的應(yīng)答時(shí)序有所不同，第18 d時(shí)，1500 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液堿性磷酸酶的活性升至最高，之后降低；36 d時(shí)，900 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液溶菌酶和過氧化物酶活性達(dá)到最強(qiáng)，隨后降低；至72 d時(shí)，900 mg/kg試驗(yàn)組半滑舌鰨鰓黏液酸性磷酸酶活性最強(qiáng)，隨后降低；

(3)從成本及提高半滑舌鰨鰓黏液免疫活性的角度出發(fā)，建議在飼料中添加 600 mg/kg 黃芪多糖較佳。

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ImmuneResponseofActivityofEnzymesRelatedtoImmunitytoAstragalusPolysaccharidesinGillMucusofSemi-smoothSoleCynoglossussemilaevis

LIU Jinhai1,2,3,LUO Xiaoli1, GUAN Jian1, HUANG Hui1,CHEN Heng1

( 1.Fisheries College，Jimei University, Xiamen 361021, China；2. Aquatic Biotechnology Research Institute，Jimei University, Xiamen 361021, China；3. Engineering Research Center of the Modern Industry Technology for Eel, Ministry of Education, Xiamen 361021, China )

Juvenile semi-smooth sole (Cynoglossussemilaevis) with body weight of (5.8±1.5) g was fed basic diet supplemented with astragalus polysaccharides (APS) at a dose of 0, 300, 600, 900, 1200, 1500 and 1800 mg/kg diet with triplication at water temperature of 25 ℃ for 90 d, and the activities of lysozyme (LSZ), peroxidase (POD), alkaline phosphatase (AKP) and acid phosphatase (ACP) in the gill mucus were detected in the sole fed the diets containing various doses of APS in a 18 day interval to investigate the immune response of activities of LSZ, POD, AKP and ACP in the gill mucus to APS and further explore the optimal dietary dose of APS. The activities of LSZ, POD and AKP were found to be first increased and then decreased in the gill mucus. The activity of ACP was shown to be elevated with elapse of APS immunity in the low dose of APS groups (300—600 mg/kg), and to be increased first and then decreased in the middle and high levels of APS groups (1200—1800 mg/kg). At the end of the experiment, there were very significantly higher activities of LSZ, POD, AKP and ACP in the gill mucus in the low and middle dose APS groups (600—900 mg/kg) than those in the control group (P<0.01). It is recommended that the optimal dietary dose of APS be 600 mg/kg diet for semi-smooth sole juveniles based on feed cost and immune efficiency.

astragalus polysaccharide; lysozyme; peroxidase; alkaline phosphatase; acid phosphatase

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.003

S942.1

A

1003-1111(2016)02-0111-06

2015-03-25；

2015-10-15.

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012J01138).

劉金海(1965-)，男，副教授；研究方向：魚類營(yíng)養(yǎng)和免疫.E-mail：hnd530@126.com.