毛細管電泳差異性檢測尿液蛋白方法初探

姚遠，景換利，高衛(wèi)平

（天津醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院,天津 300070）

論著

毛細管電泳差異性檢測尿液蛋白方法初探

姚遠，景換利，高衛(wèi)平

（天津醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院,天津 300070）

目的：使用毛細管電泳(CE)與二極管陣列檢測(DAD)聯(lián)用技術(shù)(CE-DAD)的差異檢測方法，優(yōu)化膀胱癌患者尿液特異性蛋白的檢測條件。方法：對5例膀胱癌患者及5例健康志愿者尿液蛋白中的低豐度蛋白進行含量的差異檢測，并使用電解質(zhì)添加劑對原緩沖體系進行優(yōu)化，對電滲流進行有效控制，提高低豐度蛋白的分離效率。結(jié)果：確立了使用毛細管電泳與二極管陣列檢測聯(lián)用技術(shù)對正常人組與非肌層浸潤性膀胱癌患者組尿液蛋白的差異檢測最佳條件，并經(jīng)ELISA法平行試驗，顯示兩組低豐度蛋白存在差異相關(guān)性。結(jié)論：對CE-DAD的差異檢測條件進行了初步的探索，為未來標準化檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

毛細管電泳；尿液蛋白；差異檢測；電滲流

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，患病男女比例為4∶1，其中70%～80%的患者為非肌層浸潤性膀胱癌，20%～30%為肌層浸潤性膀胱癌[1]。對于膀胱癌的臨床篩查，檢測效率尤為重要。毛細管電泳（CE）這一分離手段，因其成本低、操作簡便、耗時短等獨特的優(yōu)點而廣泛的應(yīng)用到相關(guān)檢測研究中[2-3]。本文擬探討優(yōu)化一種毛細管電泳與二極管陣列檢測器聯(lián)用技術(shù)（CE-DAD）的差異檢測方法的條件，使用超濾離心管對低豐度蛋白質(zhì)進行有效提取，并使用電解質(zhì)添加劑提高分離過程中緩沖溶液的離子強度；觀察分離過程中電流的波動情況，并通過對電流穩(wěn)定性的干預提高檢測結(jié)果的重復性，從而對正常人與膀胱癌患者的尿液低豐度蛋白質(zhì)進行差異檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Agilent 7100高效毛細管電泳儀

（美國Agilent Technology），帶有柱上二極管陣列檢測器（波長范圍:190～400 nm）；彈性石英毛細管(河北省永年縣潤豐有限責任公司），內(nèi)徑75 μm；高速冷凍離心機(德國Sigma)，用于尿液樣本的離心；

1.5 mL/100 KDa超濾離心管和 PVDF膜（德國Millipore）；BLCA-4 ELISA試劑盒（上海研生生化）；使用安捷倫化學工作站和SPSS 17.0計算機軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.2 試劑的選取與制備 在整個試劑制備過程中，所有的化學品均屬分析純及以上，試劑制備中均使用Milli-Q超濾后的超純水。原溶液的準備：乙腈、甲酸、甲醇、25%氫氧化銨溶液、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液、4 mol/L氯化鈉溶液及2%十二烷基硫酸鈉 (SDS)溶液，以上所有的溶液必須通過0.45 μm薄膜過濾器進行過濾之后使用，以防止存在大顆粒物阻塞毛細管。此外，為了防止溶液在電泳過程中產(chǎn)生氣泡，在所有樣本上機測試前，需使用超聲清洗器進行氣泡去除工作5 min。

1.3 方法

1.3.1 原理 Amaya等[4-5]使用酸性無鹽緩沖液環(huán)樣(50 mbar，180 s)，每次注入樣品之前，毛細管都必須依次通過0.10 mol/L氫氧化鈉，水，運行緩沖液分別沖洗3 min。毛細管電泳分離在電壓25 kV、溫度25℃的條件下進行，分離時間60 min。

1.3.5 ELISA蛋白鑒定方法 在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔并對標準品進行稀釋；分別設(shè)空白孔、待測樣品孔，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，混勻；置37℃溫育30 min；棄液，每孔加滿洗滌液洗滌，重復5次；除空白孔，每孔加入酶標試劑50 μL；再次溫育并洗滌；每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，混勻，37℃避光顯色15 min；加入終止液50 μL；以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 檢測波長的選取 根據(jù)DAD檢測器的檢測原理，檢測蛋白通常會選取200 nm、214 nm、254 nm和280 nm作為檢測波長。如圖1，由于本試驗緩沖液中含有尿素，尿素在短波紫外區(qū)有強吸收，其緩沖液電泳圖在短紫外區(qū)（如200 nm和214 nm）受其影響較大(如紅色點畫框所示)，因此不宜作為此試驗的檢測波長；此外，由于紫外吸收檢測法在背景緩沖液具有紫外吸收特性時會有少量補償，因此在空白檢測試驗時，緩沖液分別在200 nm、214 nm、280 nm波長下出現(xiàn)了很明顯的基線下移（右側(cè)黑體數(shù)字表示相對負吸收值），這一基線上的變化會提高物質(zhì)的檢出限，因而，為獲得更低的檢出限，減少這一補償所帶來的影響，本文選用254 nm作為檢測波長。

圖1 檢測波長的選取Fig 1 Selecting detection wavelength

2.2 對電滲流的抑制

2.2.1 緩沖液中pH值的選取 為有效控制電滲流，本文對緩沖液的pH值進行考察。圖2表明不同的pH值（2.8～4.2）對尿蛋白分離的影響。本文選用主峰即高分子量蛋白的峰高測量分辨率。隨著緩沖液pH值的增加，其分辨率也相應(yīng)增加。pH為3.6時，分辨率達到最大值，之后隨著pH值的增大而逐漸下降，因此本試驗選定緩沖液的pH為3.6。

圖2 運行緩沖液pH值的選取Fig 2 Selecting pH values of running buffer

2.2.2 分離過程中的電流控制 使用原酸性無鹽緩沖體系分離樣品時，因其電解質(zhì)含量少，加入樣本后會破壞分離過程中的背景緩沖液電解質(zhì)平衡，使得分離過程中電流波動較大，且變化無規(guī)律，相應(yīng)得到的電泳結(jié)果的重現(xiàn)性差。為獲得更好的分離效果以及重復率，使用緩沖液添加劑技術(shù)增加背景緩沖液的電解質(zhì)濃度，達到提高整體電流，穩(wěn)定電流波動的目的。

2.2.3 緩沖液中電解質(zhì)添加含量 本文對電解質(zhì)（NaCl）的添加含量進行了考察。如圖3，在0 mol和0.002 mol時，尿液蛋白分離并不完全，在0.004 mol 和0.006 mol時，尿液蛋白有了明顯的分離，然而，在0.006 mol時的蛋白電泳圖譜基線有所上揚，易破壞重復性，因此選用0.004 mol的NaCl作為電解質(zhì)添加劑。

2.2.4 毛細管有效長度選擇 由于毛細管電泳中因高電壓所帶來的焦耳熱嚴重影響著試驗的重復性，在不更改緩沖液配方的前提下，加長了毛細管的長度，選用了有效長度為816 mm的毛細管，使得平均電流值降低了近一倍，且分離過程中的電流依然保留了平緩的特性。

2.2.5 試驗方法的重復性 對同一樣本重復10次，記錄遷移時間、峰高以及峰面積，并計算10次測量的相對標準差，來比較優(yōu)化試驗條件前與優(yōu)化試驗條件后的重復率。由表1可知，檢測條件優(yōu)化后該試驗的重復率有顯著提高。

圖3 電解質(zhì)添加量的對比Fig 3 Comparison of electrophoretograms among different contents of electrolyte

表1 不同試驗條件下遷移時間、峰面積以及峰高的相對標準差(n=10)Tab 1 The%RSDs results in the different conditions(n=10)

2.3 方法驗證 為驗證該檢驗方法的可靠性，本文收集了5名患者的自發(fā)性第二次晨尿作為試驗樣本中的試驗組，另收取5名健康志愿者的自發(fā)性第二次晨尿作為試驗樣品中的對照組，兩組在年齡、性別、種族均不構(gòu)成統(tǒng)計學差異。

通過兩組電泳圖譜對比的差異來評價該檢測方法的有效性。除主峰外，有6個蛋白峰被檢測出，依次為peak‘1’、peak‘2’、peak‘3’、peak‘4’、peak ‘5’、peak‘6’，見圖4（正常人尿蛋白圖譜）和圖5（膀胱癌患者尿蛋白圖譜）。

分別對兩組中這6個峰的各個峰面積進行積分計算，并將結(jié)果分別通過t檢驗證明其差異性，數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表2。

圖4 正常人的尿液低豐度蛋白圖譜Fig 4 Separation of urinary proteomes of healthy subjects

圖5 膀胱癌患者的尿液低豐度蛋白圖譜Fig 5 Separation of urinary proteomes in patient with BCs

表2 兩組間蛋白峰的差異比較結(jié)果(t檢驗)和組內(nèi)蛋白峰的重復性考察(相對標準差)Tab 2 The difference between groups(t-test)and the repeatability in the group(%RSDs)of each peaks’areas

從表中可以看出，peak1、peak3、peak4和peak5在兩組間存在明顯的統(tǒng)計學差異，其余兩個差異不顯著。此外，還有6個峰只存在于膀胱癌患者的尿液蛋白電泳圖譜中，如圖5所示的peak‘a(chǎn)’、peak ‘b’、peak‘c’、peak‘d’、peak‘e’、peak‘f’，推測為膀胱癌患者尿液蛋白譜圖的特異性蛋白峰。

為驗證本實驗中的結(jié)果，使用ELISA方法對上述毛細管電泳實驗結(jié)果中膀胱癌患者以及正常人尿液蛋白差異進行驗證性鑒定。該平行實驗使用與上述毛細管電泳方法分離過后的膀胱癌患者與正常人尿液蛋白樣品的同源樣本作為檢測樣本，對比二者中的BLCA-4核基質(zhì)蛋白表達量。

圖6 膀胱癌患者與正常人尿液中BLCA-4的蛋白含量對比Fig 6 Up-regulation of the BLCA-4 in bladder cancer patients’urine sample

由圖6可知，BLCA-4在正常人尿液樣品中幾乎沒有表達，而在患者尿液樣品中有高表達，從而證明本實驗中毛細管電泳在膀胱癌尿液蛋白圖譜所對比得出的差異蛋白峰中應(yīng)有一個為鑒定中的BLCA-4。

3 討論

隨著尿液蛋白質(zhì)組學研究的不斷深入，目前以檢測氨基酸序列為目的的尿液蛋白質(zhì)組學的分析技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展[15-16]。一些基于質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)，如SELDI-MS[17]、2DE-MS[18]及LC-MS[19]開始廣泛用于尿液蛋白的分析。然而，因其成本高昂，耗時長，且操作復雜等原因難以在臨床中應(yīng)用[20-21]。宋瓏[22]等曾使用CE-LED-IF對尿液蛋白進行差異檢測，但蛋白提取過程過于簡單，高豐度的蛋白沒有得到有效的去除，低豐度蛋白也沒有有效的濃縮，因此實驗結(jié)果并不能強有力地證明差異的有效性。

本文探討優(yōu)化了一種使用CE-DAD技術(shù)對尿液蛋白進行差異檢測方法的條件，以用于非肌層浸潤性膀胱癌的低豐度蛋白的檢測。為獲得更好的檢測效果，本文分別對檢測波長，分離環(huán)境的pH值進行了選擇和優(yōu)化，并對分離過程中的電滲流進行了有效的控制。同時，實驗過程中還發(fā)現(xiàn)分離過程中的電流波動與分離的重復性和結(jié)果的穩(wěn)定性存在關(guān)系，為提高檢測的重復性，適當提高了緩沖液中電解質(zhì)的濃度，穩(wěn)定了分離過程中毛細管兩端的電流，并對5名已確診的非肌層浸潤性膀胱癌患者與5名正常人的尿液樣品進行差異檢測。結(jié)果顯示，共有6個蛋白峰在兩組電泳圖譜中共同存在，經(jīng)過t檢驗，其中4個蛋白峰顯示兩組間差異具有統(tǒng)計學意義，余下2個差異不明顯；另外，還有6個蛋白峰為膀胱癌患者特異蛋白峰，只存在于實驗組的電泳圖譜中；經(jīng)過ELISA方法的分析鑒定，初步證明了該方法能夠檢測出正常人尿液中和膀胱癌患者尿液中低豐度蛋白質(zhì)的差異化表現(xiàn)。本實驗僅對膀胱癌患者的毛細管電泳尿液蛋白譜圖中的特異蛋白峰進行了初步鑒定，要進一步的逐一鑒定本實驗中對比得出的差異蛋白峰，還需在后續(xù)實驗中通過毛細管與質(zhì)譜的聯(lián)用來實現(xiàn)。

綜上所述，本文優(yōu)化了毛細管電泳與二極管陣列檢測聯(lián)用技術(shù)的差異檢測條件，并對該方法的應(yīng)用進行了初步的探索，為未來標準化檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

[1] Van Rhijn B W,Burger M,Lotan Y,et al.Recurrence and progression of disease in non-muscle-invasive bladder cancer:from epidemiology to treatment strategy[J].Eur Urol,2009,56(3):430

[2] Good D M,Zuerbig P,Argiles A,et al.Naturally occurring human urinary peptides for use in diagnosis of chronic kidney disease[J].Mol Cell Proteomics，2010,9(11):2424

[3] Rossing P,Zuerbig P,Panagiotopoulos S,et al.Urinary proteomics for early diagnosis in diabetic nephropathy[J].Diabetologia,2010, 53(1):3304

[4] Albalat A,Franke J,Gonzalez J,et al.Urinary proteomics based on capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry in kidney disease[J].Methods Mol Biol，2013,919：203

[5] Weissinger E M,Mullen W,AlbalatA.Urinary proteomics employing capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry in the monitoring of patients after stem cell transplantation[J].Methods Mol Biol,2014,1109：293

[6]包日煌，范清杰，宋瓏，等.毛細管電泳-發(fā)光二極管誘導熒光檢測法分析肝硬化及正常人血清蛋白質(zhì)的差異[J].色譜，2015，33 （2）：201

[7]宋瓏，范清杰，包日煌.毛細管電泳-發(fā)光二極管誘導熒光分析尿液蛋白[J].天津醫(yī)科大學學報，2014，20（5）：404

[8] Tilki D,Burger M,Dalbagni G,et al.Urine markers for detection and surveillance of non-muscle-invasive bladder cancer[J].Eur Urol,2011,60(3):484

[9] Getzenberg R H,Konety B R,Oeler T A,et al.Bladder cancerassociated nuclear matrix proteins[J].Cancer Res,1996,56(7):1690

[10]Myers-Irvin J M,Landsittel D,Getzenberg R H.Use of the novel marker BLCA-1 for the detection of bladder cancer[J].J Urol，2005,174(1):64

[11]Konety B R,Nguyen T S,Dhir R,et al.Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein,BLCA-4[J].Clin Cancer Res, 2000,6(7):2618

[12]Konety B R,Nguyen T S,Brenes G,et al.Clinical usefulness of the novel marker BLCA-4 for the detection of bladder cancer[J].J Urol, 2000,164(3,1):634

[13]Van Le T S,Miller R,Barder T,et al.Highly specific urine-based marker of bladder cancer[J].Urology,2005,66(6):1256

[14]李飛楊，張志凌，吳松，等.BLCA-1、BLCA-4與膀胱癌關(guān)系的研究現(xiàn)狀[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2013（18）：8393

[15]Schaub S,Wilkins J,Weiler T,et al.Urine protein profiling with surface-enhanced laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Kidney Int,2004,65(1):323

[16]Theodorescu D,Wittke S,Ross M M,et al.Discovery and validation of new protein biomarkers for urothelial cancer:a prospective analysis[J].Lancet Oncol,2006,7(3):230

[17]McLerran D,Grizzle W E,Feng Z,et al.SELDI-TOF MS whole serum proteomic profiling with IMAC surface does not reliably detect prostate cancer[J].Clin Chem，2008,54(1):53

[18]Banach T,Adaszek L,Wylupek D,et al.Applicability of 2D gel electrophoresis and liquid chromatography in proteomic analysis of urine using mass spectrometry MALDI-TOF[J].Pol J Vet Sci,2013, 16(3):587

[19]Jin X,Yun S J,Jeong P,et al.Diagnosis of bladder cancer and prediction of survival by urinary metabolomics[J].Oncotarget,2014, 5(6):1635

[20]Qian W J,Jacobs J M,Liu T,et al.Advances and challenges in liquid chromatography-massspectrometry-based proteomics profiling for clinical applications[J].Mol Cell Proteomics,2006,5 (10):1727

[21]Kolch W,Neususs C,Peizing M,et al.Capillary electrophoresis-Mass spectrometry as a powerful tool in clinical diagnosis and biomarker discovery[J].Mass Spectrom Rev,2005,24(6):959

[22]宋瓏.毛細管電泳—發(fā)光二極管誘導熒光分析蛋白質(zhì)[D].天津：天津醫(yī)科大學，2014

（2016-01-04收稿）

Study on the difference detection method for urinary proteomic by CE-DAD technology

YAO Yuan,JING Huan-li,GAO Wei-ping
（College of Biomedical Engineering,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective:To explore an optimized method for difference detection of urinary proteomic in patients with bladder cancer(BCs) by capillary electrophoresis separation technique coupled with diode array detector(CE-DAD).Methods:For detecting the difference in the contents of each urinary low-abundance proteins between the two groups,electrolytic additives were used to improve the buffer system,and the concentration of electro-osmotic flow was well controlled in this condition,in order to increase the separation efficiency.Results:The optimal conditions were established to detect the difference between the bladder cancer and the control group by CE-DAD, and the difference and correlation were also tested by the parallel experiment of ELISA method.Conclusion:This paper makes a preliminary exploration on the condition of difference detection by CE-DAD,and establishes the foundation for the institution of standardized experimental method in the future.

capillary electrophoresis;urinary proteomic;difference detection;electro-osmotic flow

綜述

1006－8147（2016）04-0359-05

R318.6

A

姚遠（1991-），男，碩士在讀，研究方向：醫(yī)學儀器；通信作者：高衛(wèi)平，E-mail:gaoweiping@tijmu.edu.cn。