松墨天牛包囊蛋白基因的克隆及表達特性分析

毛珊珊，吳華俊，林 同

（華南農(nóng)業(yè)大學 林學院，廣東 廣州 510642）

松墨天牛包囊蛋白基因的克隆及表達特性分析

毛珊珊，吳華俊，林 同

（華南農(nóng)業(yè)大學 林學院，廣東 廣州 510642）

松墨天牛Monochamus alternatus是危害馬尾松樹重大蛀干害蟲，也是松材線蟲的主要傳播媒介昆蟲，對我國松林資源構成嚴重威脅。用cDNA末端快速擴增（RACE）方法克隆了松墨天牛ERP基因（MalERP），GenBank登錄號為KF357881.1。該基因含有一個長為864 bp的開放閱讀框，編碼287個氨基。同源性分析表明，MalERP與光肩星天牛Anoplophora glabripennis ERP的同源性最高，達到79%；與赤擬谷盜Tribolium castaneum的同源性為45%。實時熒光定量PCR分析顯示，MaERP在松墨天牛3齡幼蟲的脂肪體、馬氏管、中腸、體壁、血淋巴和頭部中均有表達，在脂肪體中的表達量最高；MaERP經(jīng)溴氰菊酯、磷化鋁、Bt、印楝素、綠僵菌脅迫后，上調(diào)表達；但經(jīng)阿維菌素脅迫后，下調(diào)表達。本研究為進一步研究MalERP基因在松墨天牛防御過程中的作用奠定基礎，為探索松墨天牛免疫系統(tǒng)與分子毒理互作關系提供參考。

松墨天牛；包囊蛋白；基因表達；農(nóng)藥脅迫

松墨天牛Monochamus alternates屬鞘翅目天牛科，是一種危害馬尾松樹的蛀干害蟲，又是松材線蟲病的主要媒介昆蟲，對我國松林資源己構成嚴重威脅[1]。

昆蟲的天生免疫可以簡單的分為體液免疫和細胞免疫[2]，當入侵物較多時，細胞通過吞噬作用清除入侵物，當外源物太大而不能被血細胞吞噬時，包括寄生蜂卵和幼蜂，真菌和原生動物寄生蟲，甚至非生物對象[3-4]，昆蟲血細胞常會在外源物外形成一層或多層的鞘狀物質(zhì)以包囊外源物來殺死病原物[5]。一般認為：當外源物進人寄主血腔后，寄主血細胞與外源物隨機接觸，若顆粒血細胞接觸到外源物，在原酚氧化酶級聯(lián)產(chǎn)物、凝集素等的協(xié)助下，它能夠識別外源物為“異己”進而附于外源物上，并釋放出識別因子以吸引漿血細胞。漿血細胞附著后，在顆粒血細胞與外源物的復合體上延展，并且漿血細胞間常會形成粒橋、微管，這樣層層埋集，形成包囊[6-7]。包囊是無脊椎動物對抗外源物質(zhì)的主要防御反應[8]。在不同種的昆蟲中，參與包囊反應的細胞種類也有所差異。在鱗翅目中，參與包囊作用的主要是粒細胞和漿細胞，而在果蠅Drosophila melanogaster中是葉狀細胞[9]。

包囊蛋白（encapsulation-relating protein，ERP）是昆蟲產(chǎn)生包囊反應時最先在外來物周圍積聚的蛋白[8]。目前國內(nèi)外對ERP的研究較少，最早測得的鞘翅目ERP基因來自黃粉蟲Tenebrio molitor。本研究用cDNA末端快速擴增（Rapid ampli fi cation of cDNA ends,RACE）方法克隆了松墨天牛ERP基因，用實時熒光定量PCR (Realtime quantitative PCR,RT-qPCR) 分析該基因在不同組織中的表達譜，為進一步研究該基因在松墨天牛防御反應中的作用奠定基礎。通過探討不同農(nóng)藥處理后ERP基因表達情況，為探索松墨天牛免疫系統(tǒng)與分子毒理互作關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 松墨天牛

松墨天牛幼蟲采自廣州市蘿崗區(qū)馬尾松次生林，配置人工飼料[10]，置于智能人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為黑暗、溫度(25士1.0)℃、相對濕度70%～75%。

1.2 組織分離

選取松墨天牛3齡幼蟲，用酒精消毒蟲體并對其麻醉。用解剖針將幼蟲固定在解剖板上，背部向上，用剪刀剖開，移液器收集血淋巴；解剖鏡下分別分離脂肪體、馬氏管、中腸、頭部和體壁，置于離心管中立即用液氮處理，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

pMD20-T Vector試 劑 盒、E.coliDH5α Competent Cells、Taq DNA聚合酶、dNTP 購自寶生物公司(TaKaRa)；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、DNA cloning Vector 試劑盒、T4 DNA連 接 酶、EZ Spin column total RNA Isolation Kit、3'Full RACE Core Set Ver.2.0 kit、LA Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、IPTG、X-Gal購自上海生工生物技術有限公司； PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser、 pMD20-T Vector試 劑 盒、E.coliDH5α Competent Cells、SYBR? Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司；Universal通用型DNA純化回收試劑盒、DNA Marker (D2000)、質(zhì)粒小提試劑盒、氨芐青霉素鈉鹽等購自天根生化科技有限公司。

1.4 松墨天?？俁NA的提取

從-80℃冰箱中取出松墨天牛幼蟲樣品，參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書提取松墨天?？俁NA。純化后的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，并用微量紫外分光光度儀 (Nanodrop 2000) 檢測其純度并定量后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RACE方法擴增ERP基因

本研究在以往獲得的松墨天牛ERP基因5'端序列（GenBank:JZ143844）[11]的基礎上進行3'RACE擴增，以獲得松墨天牛ERP基因全序列。用DNAStar中的Primer select軟件設計EPR基因特異性引物（ERPouter,ERPinner,見表1），結(jié)合試劑盒提供的兩個下游引物 3'RACE outer Primer 和3'RACE inner Primer 進行巢式 PCR[12]。首先用通用引物3'RACE Outer Primer和特異性引物ERPouter進行第一次 Outer PCR擴增， PCR反應條件為：94℃預變性 3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min，20個循環(huán)，然后72℃延伸 10 min。反應完畢后取1 μL反應產(chǎn)物，使用通用引物3'RACE Inner PCR 和特異性引物ERPinner進行巢式PCR的Inner PCR擴增。反應進行30個循環(huán)，其它反應條件同第一次 Outer PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)由2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Universal通用型DNA純化回收試劑盒回收目的DNA片段，與pMD20-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選，挑陽性菌落提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定后送上海生工生物技術有限公司測序。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in the study

1.6 序列分析

使用DNAMAN軟件將測得的ERP基因序列進行拼接和開放閱讀框（ORF）預測，所得序列在NCBI上進行同源性比較分析 (http://www.Ncbi.Nlm.gov/blast/)； 使 用 BioEdit、ProtScale等 軟 件對推測的ERP進行氨基酸組成、疏水性分析；用TMpred (http://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) 進行跨膜區(qū)分析，預測跨膜蛋白的跨膜片段；COILS Server（http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) 預測卷曲螺旋；NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 預 測 磷酸化修飾位點；丹麥科技大學(DTU) 的CBS服務器上的SignalP 4.0 Server程序進行蛋白質(zhì)序列的信號肽 (signal peptide) 預測 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；用NCBI (http: //www. Ncbi. nlm.Nih. gov/) 中的blastx程序進行同源性比對[13]。

1.7 農(nóng)藥處理

用6種農(nóng)藥對松墨天牛3齡整只幼蟲噴霧或熏蒸，每種農(nóng)藥處理設3個重復，每個重復10頭幼蟲。磷化鋁熏蒸持續(xù)進行1.5 d，其他農(nóng)藥噴霧處理后，將試蟲靜置6 h；之后將每種農(nóng)藥處理的試蟲分別提取RNA，等量混合，作為RT-qPCR樣品。使用的藥劑名稱和使用方法等詳見表2。

1.8 RT-qPCR

獲得ERP的ORF后，以此設計引物（RT-qPCRF， RT- qPCR，見表1）。RNA提取方法同1.4，按照 PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser說明合成cDNA第1鏈。以β-actin （見表1）為內(nèi)參基因，以無菌超純水為陰性對照。每個反應設置3個平行實驗[14]。兩步法PCR反應程序為：95℃ 5 min ，1個循環(huán)（預變性）；95 ℃ 10 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)(PCR反應)；40℃ 30 s (冷卻）。反應結(jié)束后采集目標基因的 Ct 值和兩個內(nèi)參基因的 Ct 平均值，利用 2-ΔΔCT相對定量法計算ERP的相對表達量。 RT-qPCR在LightCycler Real Time PCR中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 松墨天牛ERP基因的克隆與序列分析

用DNAMAN軟件將測序所得的序列和原序列拼接結(jié)果如圖1所示，該序列全長為1 571 bp，3′端包含12 bp的PolyA尾巴和一個特征性序列AATAAA。經(jīng)過DNAMAN預測，該序列ORF為864 bp，編碼287個氨基酸，推測分子量為31.772 kDa， 將松墨天牛ERP基因命名為MaERP，GenBank登錄號為KF357881.1。

圖1 MaERP基因全長及其推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MaERP

由MaERP推測的蛋白Gln （谷氨酰胺）含量最多，摩爾百分比接近18%； Gly（甘氨酸）含量次之，摩爾百分比達10%。此結(jié)果與黃粉蟲幼蟲56 kDaERP的氨基酸組成特點一致，黃粉蟲的ERP組成特點是富含Gln（谷氨酰胺），Gly含量也居第二位。在8～13氨基酸位含有一個跨膜片段，方向為膜內(nèi)向膜外，且為疏水性區(qū)域；含有6個卷曲螺旋，有絲氨酸磷酸化位點15個，酪氨酸的磷酸化位點8個，蘇氨酸的磷酸化位點3個。蛋白質(zhì)磷酸化是將外界刺激轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號的一個主要機制，是生物界最普遍也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（Post-Translational Modi fi cations，PTMs）。由此可知此類蛋白參與免疫過程的胞內(nèi)信號傳導。信號肽序列為MKCILLLTFVALCYSYPSGYDTAYGGSGRN，信號肽的剪切位點位于第15和16位氨基酸處。

2.2 同源性比對

經(jīng)由blastx做出的MaERP與其它4種昆蟲ERP的氨基酸序列同源性比對的結(jié)果（見圖2）可知，MaERP與光肩星天牛Anoplophora glabripennis ERP同源性最高，高達79%；與赤擬谷盜Tribolium castaneum和黃粉蟲的同源性分別為45%和43%；與玉米根蟲Diabrotica virgifera的同源性最低，為26%。

圖2 MaERP與其它4種昆蟲 ERP氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of MaERPfrom M. alternatusand ERPs from other 4 insects

2.3 MaERP表達分析

如圖3所示，MaERP在脂肪體中的相對表達量最高，是體壁的13.2倍；在馬氏管、中腸和血淋巴中的表達量分別為在體壁中的3.1倍、1.7倍和1.4倍；在頭部的相對表達量最低，僅為在體壁中的10%。

圖3 松墨天牛幼蟲不同組織中MaERP表達譜Fig.3 Expression pro fi les of MaERP in different tissues of 98 larvae detected by RT-qPCR

由圖4可知，經(jīng)阿維菌素脅迫后，MaERP的相對表達量最低，只是對照的0.05倍，為下調(diào)表達，說明阿維菌素明顯抑制了MaERP的表達；溴氰菊酯、磷化鋁、Bt.、印楝素、綠僵菌脅迫后，MaERP的表達量分別是對照的134.5倍、111.1倍、82.3倍、56.5倍和31.4倍，為上調(diào)表達，表明這5種農(nóng)藥對MaERP的表達起增強作用。

圖4 農(nóng)藥脅迫對MaERP表達量的影響Fig.4 Expression levels of MaERPafter pesticide stress

3 結(jié)論與討論

本研究用RACE方法成功克隆了MaERP基因，該基因的ORF為864 bp，編碼287個氨基酸；MaERP與光肩星天牛ERP氨基酸同源性為79%；MaERP在松墨天牛3齡幼蟲的脂肪體、馬氏管、中腸、體壁、血淋巴和頭部中均有表達，但在頭部的表達量最低；MaERP在溴氰菊酯、磷化鋁、Bt、印楝素、綠僵菌等5種農(nóng)藥脅迫下上調(diào)表達，在阿維菌素脅迫下下調(diào)表達。

通過對MaERP基因編碼蛋白結(jié)構的分析，推測MaERP可能是一種產(chǎn)生于細胞膜內(nèi)而分泌于細胞膜外、直接對細胞壁起作用的蛋白。由于細胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，因此，合成的蛋白質(zhì)必須準確無誤地定向運送才能保證生命活動的進行。一般認為，蛋白質(zhì)定位的信息存在于該蛋白質(zhì)自身結(jié)構中，并且通過與膜上特殊受體的互相作用得以表達。在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列RNA片段，這個氨基酸序列就稱為信號序列。本研究預測的MaERP信號肽位置與長度和Cho等人通過分子克隆和化學分析法得到的黃粉蟲56 kDa ERP所預測到的信號肽的位置和長度相同，都處于N末端；而且剪切位點的位置也都在15位和16位氨基酸之間[8]。此結(jié)果表明得到了完整的MaERP開放閱讀框。下一步可以表達出MaERP，對其進行亞細胞定位，以期深入研究MaERP的功能。

昆蟲的脂肪體是其體內(nèi)的一種重要結(jié)構,它既是糖、脂和蛋白質(zhì)代謝的中心，又是主要激素（如神經(jīng)激素、蛻皮激素、保幼激素）作用的靶組織，還具有貯存排泄和解毒等生理功能。Cho等通過蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲幼蟲中的86 kDa ERP在血淋巴和脂肪體中的含量明顯較多，表明ERP在脂肪體中合成并分泌到血淋巴中[8]。根據(jù)本研究中RT-qPCR分析的結(jié)果，在松墨天牛3齡幼蟲各組織中，脂肪體中MaERP相對表達量最大，為在體壁中表達量的13.2倍，與Cho等的結(jié)果[8]一致。推測ERP在昆蟲的脂肪體中的含量是最高的。

昆蟲的表皮層作為首要物理及化學屏障能夠有效阻止病原物的附著與入侵。昆蟲消化道作為病原物入侵的另一個主要途徑，能夠有效阻滯病原物入侵，抑制病原物活性，消解病原物殘體。昆蟲最初的防御是以體壁作為物理屏障，其次的防御是中腸及血淋巴中的凝集反應，還有細胞毒素分子在受傷部位形成的多種產(chǎn)物[7]。MaERP在馬氏管、中腸和血淋巴中的表達量為在體壁中的1～3倍，表明ERP在體壁、馬氏管、中腸和血淋巴中均可能參與細胞免疫包囊反應。相對于體壁，MaERP在松墨天牛頭部的表達量最少，僅為在體壁中的0.1倍，預示在頭部的包囊反應較為薄弱。

阿維菌素對蟲體的作用機制是使神經(jīng)膜處于抑制狀態(tài)，阻斷神經(jīng)沖動傳導而使昆蟲喪生[15]。經(jīng)阿維菌素處理后，MaERP的表達量僅為對照的0.05倍，說明阿維菌素對MaERP的表達有極強的抑制作用。推測阿維菌素也影響到了松墨天牛的免疫系統(tǒng)。

在溴氰菊酯等其它5種農(nóng)藥作用下，MaERP上調(diào)表達，表明這些農(nóng)藥可能刺激了松墨天牛產(chǎn)生包囊反應，因而致使ERP的表達量增高。昆蟲具備相當完善的先天免疫系統(tǒng)，它可通過特定的蛋白分子快速有效地介導整個免疫過程。昆蟲居住環(huán)境的類型較為復雜，為了應對外部的選擇壓力，昆蟲已進化出不同類型且高效的防御策略，以更好地保護自己，抵御外來物，包括農(nóng)藥的入侵。研究因分子介導所產(chǎn)生的對包囊反應的抑制或誘發(fā)，有助于了解無脊椎動物細胞免疫反應的基本過程[16]。本研究中使用的農(nóng)藥分屬于植物性農(nóng)藥、微生物農(nóng)藥、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、內(nèi)酯類抗生素等，殺蟲機理不同，可為探索不同類型農(nóng)藥的分子毒理和包括包囊作用在內(nèi)的昆蟲防御反應之間的互作提供參考。

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Cloning and expression of encapsulation-relating protein gene of Monochamus alternatus

MAO Shan-shan,WU Hua-jun,LIN Tong
(College of Forestry,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,Guangdong,China)

Pine sawyer,Monochamus alternatus Hope (Coleoptera: Cerambycidae),a serious trunk borer in pines stands,also is a major media insects of pine wood nematode,posed a serious threat to the forest resources in China. It is the key vector of the exotic pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus throughout Asia. The ERP gene from M. alternates,called MaERP (GenBank accession number is KF357881.1),was cloned and sequenced by rapid ampli fi cation of cDNA ends. Sequence analysis revealed that the open reading frame of MaERP had 864 bp in full length encoding a 287 predicted amino acids residues. Blastx showed that MaERP and Anoplophora glabripennis had EPR homology,up to 79%,and had EPR homology to Tribolium castaneum,being 45%. The Real-time PCR quantitative analysis showed that MaERP was expressed in body wall,head,midgut,Malpighian tubule and hemolymph from the 3rdinstar larvae of M. alternatus,and expressed in fat body with the highest expression. The RT-qPCR also indicated that MaERP was upregulated when exposed to Metarrhizium anisopliae,azadirachtin,aluminum phosphide,Bt and deltamethrin,and downregulated when exposed to avermectin.The findings of the study lay a foundation for further research on MalERP’s defensive reaction to M.alternatus,provide a reference for studying the interaction between immune system and molecular toxicology of M. alternates.

Monochamus alternatus; encapsulation-relating protein; gene expression; pesticide stress

S718.7

A

1673-923X(2016)01-0107-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.01.018

2014-05-10

國家自然科學基金項目（31170612）

毛珊珊，碩士研究生 通訊作者：林 同，副教授，博士；E-mail：lintong@scau.edu.cn

毛珊珊，吳華俊，林 同. 松墨天牛包囊蛋白基因的克隆及表達特性分析[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016,36(1): 107-111,133.

[本文編校：謝榮秀]