掌葉半夏提取物PE聯(lián)合順鉑對宮頸癌荷瘤裸鼠的體內(nèi)毒性評價

文海肖 張明星 李桂玲 徐叢劍

(1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院-上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室 上海 200011;2復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032)

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掌葉半夏提取物PE聯(lián)合順鉑對宮頸癌荷瘤裸鼠的體內(nèi)毒性評價

文海肖1▲張明星1▲李桂玲1 △徐叢劍1,2

(1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院-上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室 上海 200011;2復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032)

目的 探索掌葉半夏提取物(extract fromPinelliapedatisectaSchott,PE)體內(nèi)聯(lián)合順鉑(Cis-dichlorodiammine platinum-II,CDDP)抑制宮頸癌時對裸鼠的毒性,評價PE作為宮頸癌順鉑化療協(xié)同藥物的安全性。方法 取40只BALB/c雌性裸鼠,建立CaSki皮下移植瘤模型后,隨機分為4組:(1) 對照組;(2) PE組:每日20 mg/kg (灌胃);(3) CDDP組:每周5 mg/kg (腹腔注射);(4) PE+CDDP組:PE每日20 mg/kg (灌胃)+ CDDP每周5 mg/kg (腹腔注射)。連續(xù)給藥3周,觀察各組小鼠每日攝食和一般情況,每3天稱體質(zhì)量;第22天采血后處死裸鼠,獲取裸鼠重要臟器,測量臟器質(zhì)量,計算臟器系數(shù);HE染色觀察主要臟器組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),ELISA檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(creatinine,Cr)水平。結(jié)果 給藥3周后,各組裸鼠生長良好、飲食正常、皮毛光滑、日常活動活躍,無一只死亡。CDDP 組小鼠體重逐漸下降,實驗結(jié)束時PE+CDDP組小鼠體重大于CDDP組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。光鏡下,各組小鼠心、肝脾、肺、腎、卵巢、子宮組織結(jié)構(gòu)均未見明顯異常。血清AST和Cr水平在4組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而CDDP組ALT水平明顯高于對照組、PE組和PE+CDDP組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 PE能改善CDDP引起的裸鼠體重下降及肝酶升高的作用,是一種安全的中藥。

掌葉半夏提取物; CDDP; 宮頸癌; 體內(nèi); 毒性; 裸鼠

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一,2012年全球約有52萬新發(fā)病例和26萬死亡病例[1]。對于晚期宮頸癌患者,尤其是存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或需要保留生育功能的患者,化療具有非常重要的意義。宮頸癌化療主要是以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合方案,然而藥物的毒性作用以及腫瘤細(xì)胞對化療藥的耐藥對治療效果產(chǎn)生極大的限制,因此,我們希望從中西醫(yī)結(jié)合的角度來探尋新的治療手段。

掌葉半夏為天南星科植物掌葉半夏的塊莖,又名虎掌南星,有定驚祛風(fēng)、化痰散結(jié)之功效。20世紀(jì)70年代,復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院先后用掌葉半夏治療宮頸癌患者247例,治療期在2個月以上,未發(fā)現(xiàn)明顯毒性作用和不良反應(yīng),充分證實了掌葉半夏臨床治療宮頸癌的有效性和安全性[2]。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)展,中國科學(xué)院上海藥物所近期從掌葉半夏中分離純化出一種新的脂溶性提取物(extract frompinelliapedatisectaschott,PE),活性測試證實PE的活性明顯強于掌葉半夏其他已知或未知的成分,且該提取物具有嚴(yán)格的提純工藝質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。前期實驗證實PE對宮頸癌細(xì)胞株CaSki和HeLa表現(xiàn)出明顯抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[3-7],體內(nèi)抑瘤實驗[8]也證實了PE的體內(nèi)抑瘤作用,但PE的體內(nèi)毒性有待進(jìn)一步評價。本文將在前期實驗[9]發(fā)現(xiàn)PE與一線化療藥物順鉑在體外有協(xié)同抗宮頸癌作用的基礎(chǔ)上,應(yīng)用動物模型對PE與順鉑聯(lián)合抑制宮頸癌時的體內(nèi)毒性進(jìn)行評價。

材 料 和 方 法

藥物、試劑和儀器 PE由中國科學(xué)院上海藥物所天然藥化研究室提供,二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)(Sigma,D-5879)溶解,過濾除菌,冷藏備用,金龍魚食用葵花籽油稀釋灌胃;注射用順氯氨鉑(cisplatin,CDDP)干粉劑,規(guī)格100 mg/支(中國食品藥品鑒定研究所)。超凈工作臺(Heal Force,safe-1200),二氧化碳培養(yǎng)箱(Heal Force,90/HF240),倒置相差顯微鏡(Olympus,CKX41),全自動細(xì)胞計數(shù)儀(Bio-Rad,TC-10),微量電子天平(Sartorius,BSA224S),RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素均購于GIBCO公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(Biovision,K752-100),天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(Biovision,K753-100),肌酐(creatinine,Cr)試劑盒(ab65340)購于Abcam公司,高頻率超聲波分散儀(SY-1200T)。

動物 動物和瘤株 BALB/c-nu裸小鼠40只,雌性,6～8周齡,體質(zhì)量18～22 g,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心,飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)動物實驗科學(xué)部SPF級動物實驗室,動物合格證號:SCXK (滬) 2012-0002。人宮頸癌細(xì)胞株CaSki引自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC,CRL-1550),經(jīng)中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫復(fù)蘇后提供。

細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)方法復(fù)蘇凍存于液氮罐中的宮頸癌CaSki細(xì)胞,培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,置于5%CO2孵箱、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%融合時(2～3天)用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化細(xì)胞并代。

宮頸癌裸小鼠皮下移植瘤模型的建立、分組及藥物處理 裸小鼠適應(yīng)環(huán)境7天后,取對數(shù)生長期的人宮頸癌CaSki細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后220×g離心3 min,用RPMI 1640培養(yǎng)液配置成1×107/mL單細(xì)胞懸液,消毒裸鼠皮膚后用1 mL注射器于裸小鼠右側(cè)頸背部皮下接種0.2 mL/只。接種12～14天后,瘤體直徑長到約5 mm大小,將40只CaSki裸鼠皮下移植瘤模型的小鼠用隨機數(shù)字表法將其均分為4組:對照組,PE組(每天20 mg/kg),順鉑組(CDDP,5 mg/kg,ip,每周1次),PE+CDDP組(PE灌胃/順鉑腹腔注射給藥,用法同前),連續(xù)用藥3周。

實驗觀察項目 一般情況和活動行為觀察(毛發(fā)、精神狀態(tài)、尿液和糞便性狀、顏色、飲食及體重變化),每3天測1次體質(zhì)量,發(fā)現(xiàn)有中毒反應(yīng)的動物要取出單籠飼養(yǎng),死亡或瀕死動物及時尸檢。

血液生化檢測 最后1次給藥24 h后,每只斷頸取血約0.6 mL,離心取血清,分離血清進(jìn)行血液生化檢測。指標(biāo)包括:AST、ALT、Cr,嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

臟器系數(shù)計算及組織學(xué)檢查 處死裸鼠后取出肝、腎、脾、心、肺、子宮和卵巢等重要臟器,肉眼觀察并稱重,計算各臟器系數(shù)。解剖觀察體內(nèi)臟器情況,取臟器組織,放入4%甲醛溶液固定、制片,顯微鏡下觀察各臟器組織結(jié)構(gòu)。臟器系數(shù)(g/100 g)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100。

結(jié) 果

動物一般情況 實驗期間各組裸鼠飲食、精神狀態(tài)佳,活動及大小便無明顯異常變化,實驗期間無小鼠死亡。每3天測1次體質(zhì)量,結(jié)果如圖1所示,PE組與對照組的小鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.749 1);PE+CDDP組小鼠體質(zhì)量明顯大于CDDP組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.005)。

vs.PE+CDPD,(1)P< 0.005.

圖1 裸鼠的體重變化

Fig 1 The body weight change in nude mice

臟器指數(shù) 結(jié)果如表1所示,對照組、PE組、CDDP及PE+CDDP組間臟器指數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 掌葉半夏提取物PE裸鼠毒試驗臟器指數(shù)的影響

血清生化指標(biāo) 結(jié)果如圖2、3、4所示,小鼠血清AST活性和Cr濃度,PE組與PE+CDDP、CDDP及對照組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而小鼠血清ALT活性,CDDP組與PE+CDDP組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。

圖2 各組裸鼠血清AST活性

Fig 2 AST activity of nude mice

圖3 各組裸鼠血清ALT活性

Fig 3 ALT activity of nude mice

圖4 各組裸鼠血清肌酐濃度

Fig 4 Creatinine concentration of nude mice

臟器病理組織學(xué)變化 取各組小鼠心、肝、腎、脾、肺、卵巢、子宮組織器官進(jìn)行病理組織學(xué)觀察,各組小鼠臟器HE染色(圖5)。圖中HE染色結(jié)果顯示各組小鼠臟器均呈現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)。肝細(xì)胞呈多邊形,界限清楚,胞質(zhì)豐富,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,中央靜脈及其周圍肝細(xì)胞索可辨。腎臟可見結(jié)構(gòu)完整正常大小的腎小球和腎小囊。小鼠脾臟皮髓交界明顯,白髓和紅髓中有密集的淋巴細(xì)胞分布。肺臟組織染色可見清晰的肺泡、支氣管結(jié)構(gòu)。心臟HE染色可見梭形平滑肌細(xì)胞。子宮HE染色可見正常的內(nèi)膜層、肌層和漿膜層。卵巢可見成熟的卵泡和大量排卵后黃體組織,始基卵泡少見。

討 論

宮頸癌每年約有50萬新發(fā)病例和26萬死亡病例[1]。宮頸癌發(fā)病率逐年上升[10],平均年增長率為0.6%,且發(fā)病及死亡高發(fā)年齡呈現(xiàn)明顯的年輕化趨勢[11-12]。居高不下的復(fù)發(fā)率給治療帶來困難。宮頸癌的傳統(tǒng)治療模式為手術(shù)加放療,化療僅僅用于不能手術(shù)或放療的晚期患者、復(fù)發(fā)及盆腔外轉(zhuǎn)移患者的姑息治療。隨著化療藥物的不斷更新?lián)Q代、給藥方法和給藥途徑的不斷改善,化療可有效治療手術(shù)和放療不能控制和消除的亞臨床和微小轉(zhuǎn)移病灶。宮頸癌的高復(fù)發(fā)率以及部分年輕患者對于保留生育功能的渴求[13-14],均使得化療在宮頸癌治療中的地位不斷提升,成為治療宮頸癌的重要手段之一。對于轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者,順鉑仍是有效的單藥。但順鉑毒性作用和不良反應(yīng)大,一定程度限制了其臨床應(yīng)用。為了克服順鉑的毒性作用和不良反應(yīng),臨床上需要高效低毒的藥物用于順鉑化療的輔助用藥,從而提高順鉑對腫瘤細(xì)胞的作用,減少其用量,起到化療協(xié)同作用。目前,與順鉑聯(lián)合用于宮頸癌化療的臨床藥物均具有嚴(yán)重毒性作用和不良反應(yīng),因此,從中藥中尋找與順鉑有協(xié)同作用且毒性作用和不良反應(yīng)小的藥物將具有重要意義。有研究揭示[15-16]與化療藥物有協(xié)同作用的抗腫瘤中藥單體或復(fù)方可以使藥物在治療安全范圍內(nèi)產(chǎn)生更好的療效,即中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤比單純西藥或中藥治療具有更好的療效和更低的不良反應(yīng)。我們關(guān)注的是傳統(tǒng)中藥掌葉半夏。

掌葉半夏系天南星科、半夏屬、掌葉半夏的塊莖產(chǎn)于我國大部分地區(qū)?！侗窘?jīng)》及《本草通玄》中記載,掌葉半夏味辛、性溫、有毒,具有消腫散結(jié)、祛風(fēng)定驚、燥濕化痰的功效,用于治療中風(fēng)痰壅、口眼歪斜、半身不遂、癰腫、跌打損傷等,外用可治療無名腫毒及毒蛇咬傷。目前已知的掌葉半夏化學(xué)成分主要有生物堿、谷甾醇、甙類、二肽類、氨基酸等,還有很多成分未明[17]。掌葉半夏提取物PE的抑瘤活性明顯強于掌葉半夏其他已知或未知的成分。本研究將在前期實驗的基礎(chǔ)上對PE單獨或與順鉑聯(lián)合抑制宮頸癌時的體內(nèi)毒性進(jìn)行初步評價。

Uterus,ovary,heart,lung,liver,spleen and kidney were obtained from the same mouse of each group.

圖5 掌葉半夏提取物PE在裸鼠體內(nèi)毒性實驗中各器官組織的HE染色(×40)

Fig 5 HE staining of organs of nude mice in PE toxicity experiment(×40)

本文對藥物干預(yù)后實驗動物的一般情況、體質(zhì)量、血清生化指標(biāo)、臟器系數(shù)及組織病理等方面進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示,實驗期間各組裸鼠飲食正常,精神狀態(tài)佳,皮毛光滑,活動及大小便均無明顯異常變化。PE組與對照組小鼠體質(zhì)量比較無明顯變化,而PE+CDDP組小鼠體質(zhì)量明顯大于CDDP組,說明PE可以改善CDDP引起的動物體質(zhì)量下降。

評估藥物對各臟器功能的影響可采用多種方法評估。臨床上,ALT和AST的變化能敏感地反映肝細(xì)胞是否損傷及損傷嚴(yán)重程度,是因為肝臟是含酶極為豐富的器官,酶蛋白含量占肝臟總蛋白的2/3左右,肝臟中轉(zhuǎn)氨酶的濃度比血中高幾千倍。故在肝細(xì)胞損傷時,轉(zhuǎn)氨酶由高濃度向低濃度釋放,即使肝細(xì)胞輕微的損害,就可使血中ALT濃度的上升。所以血清酶學(xué)(主要為AST和ALT)的檢查是用來監(jiān)測肝細(xì)胞是否受損的最有效、最實用的檢測方法。臨床上,Cr是監(jiān)測腎臟損傷引起腎臟功能不全的敏感指標(biāo)。Cr主要由腎小球濾過排泄。腎小球濾過率下降時Cr濃度就升高。所以AST、ALT和Cr可作為藥物毒性實驗的檢查指標(biāo)。本實驗中小鼠血清ALT活性,PE組、對照組及PE+CDDP組間未見明顯差異,而PE+CDDP組小鼠血清ALT活性明顯低于CDDP組,說明PE在體內(nèi)無毒性,并且能改善順鉑引起的肝酶升高的毒性作用和不良反應(yīng)。臟器系數(shù)=實驗動物某臟器質(zhì)量/其體質(zhì)量,臟器系數(shù)增大表示該臟器充血水腫、增生肥大等,臟器系數(shù)降低表示壞死萎縮可能。而病理組織學(xué)檢查是反應(yīng)藥物毒性效應(yīng)的形態(tài)學(xué)依據(jù)。本實驗中,PE組與對照組小鼠相比,心、肺、脾、肝、腎及卵巢的臟器系數(shù)相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,HE染色結(jié)果顯示小鼠臟器均呈現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)掌葉半夏提取物PE對CaSki瘤株裸鼠的一般行為無明顯影響,對心、肺、肝、腎等重要臟器組織結(jié)構(gòu)未見明顯毒性反應(yīng)。同時發(fā)現(xiàn)PE能夠改善CDDP引起的動物體重下降和肝酶升高的毒性作用和不良反應(yīng)。綜合各項指標(biāo),掌葉半夏提取物PE在體內(nèi)應(yīng)用是安全的,并且能降低順鉑抑瘤時的毒性,其有望成為宮頸癌化療中與順鉑協(xié)同作用的藥物。

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Experimental research on toxicity of extract from Pinellia pedatisecta Schott when combined with cisplatin on tumor-bearing nude mice

WEN Hai-xiao1▲, ZHANG Ming-xing1▲, LI Gui-ling1△, XU Cong-jian1,2

(1ObstetricsandGynecologyHospitalofFudanUniversity-ShanghaiKeyLaboratoryofFemaleReproductiveEndocrineRelatedDiseases,Shanghai200011,China;2InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To explore the security of PE (extract fromPinelliapedatisectaSchott,PE) as a new drug to assist cisplatin (Cis-dichlorodiammine platinum-II,CDDP) in inhibiting cervical cancer,and to evaluate the toxic effect of PE when combined with CDDP on tumor-bearing nude mice.Methods Forty CaSki tumor-bearing BALB/C nude mice were established,then they were randomly divided into 4 groups:control group,PE group (20 mg/kg per day,intragastric administration) cisplatin group (CDDP,5 mg/kg per week,intraperitoneal injection),and PE+CDDP group (PE 20 mg/kg per day + CDDP 5 mg/kg per week).The normal behavior and diet of mice was observed,the weight of mice was measured per 3 days for 3 weeks,and then mice were sacrificed.Serum and vital organs of mice were obtained,viscera index was calculated.Histopathology of organs was by HE staining.Meanwhile,concentration of alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST) and creatinine (Cr) of blood serum samples were analyzed by ELISA. Results PE had no side effect on the normal behavior of these nude mice and no mouse died.Compared with CDDP group,the weight of PE+CDDP group gained significantly (P<0.05).No damage was found of PE on the histomorphology of major organs,including heart,lung,spleen,liver,kidney,uterus,and ovary by using HE staining.Concentration of AST and Cr of PE group had no obvious difference between the four groups (P>0.05).However,concentration of ALT in CDDP group was higher than the other three groups (P<0.05). Conclusions PE can improve the weight loss and liver enzyme elevation induced by CDDP,and it is a safe medicine.

extract fromPinelliapedatisectaSchott; CDDP; cervical cancer;invivo; toxicity; nude mice

國家自然科學(xué)基金面上項目(81373867)

R737.33

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.004

2015-12-28;編輯:沈玲)

▲WEN Hai-xiao and ZHANG Ming-xing contributed equally to this work

△Corresponding author E-mail:fckzxy@126.com

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81373867).