蘿卜硫素制備及純化工藝研究進展

吳元鋒,徐維亮,申雨珂,肖功年,毛建衛(wèi),*,黃 俊,尤玉如

(1.浙江科技學院生化學院/輕工學院,浙江杭州 310023; 2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江杭州 310023; 3.浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心(2011協(xié)同創(chuàng)新中心),浙江杭州 310023)

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蘿卜硫素制備及純化工藝研究進展

吳元鋒1,2,3,徐維亮1,2,3,申雨珂1,2,3,肖功年1,2,3,毛建衛(wèi)1,2,3,*,黃 俊1,2,3,尤玉如1,2,3

(1.浙江科技學院生化學院/輕工學院,浙江杭州 310023; 2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江杭州 310023; 3.浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心(2011協(xié)同創(chuàng)新中心),浙江杭州 310023)

本論文主要對蘿卜硫素的制備和純化方法等方面進行了綜述。主要采用的蘿卜硫素制備方法有化學合成法、酶法、半合成法等,純化方法主要有大孔樹脂吸附法、硅膠柱色譜法、制備液相色譜法和高速逆流色譜法等。最后,論文對蘿卜硫素制備及純化等方面的研究前景做了探討。

蘿卜硫素,制備,純化,進展

蘿卜硫素(sulforaphane,1-異硫氰酸酯(4R)-(甲基亞磺酰基)丁烷)又稱萊菔硫烷,是西蘭花等蕓薹屬植物中的蘿卜硫苷(4-甲基亞磺?；∠┗虼咸烟擒?Glucoraphanin)經黑芥子酶水解產生的異硫氰酸酯類化合物[1]。大量的研究表明蘿卜硫苷沒有生物活性[2],然而水解生成的蘿卜硫素卻具有多種生理活性,如抑制癌細胞增殖、誘導細胞周期阻滯和凋亡、抑制腫瘤轉移、抗氧化、免疫調節(jié)、抗炎等[3-4]。蘿卜硫素具有這些生理活性是因為其具有抑制階段I藥物代謝酶、激活階段Ⅱ藥物代謝酶、誘導NF-E2相關因子(Nrf2)、抑制核轉錄因子κB(NFκB)、抑制組蛋白去乙?；傅榷喾N活性[5-7]。作者團隊的研究結果表明,蘿卜硫素抑制了小鼠B16黑色素瘤細胞的組蛋白去乙酰化酶活性,使Bax和p21表達上調,從而誘導B16細胞凋亡和周期阻滯[8]。因此蘿卜硫素是一種很有潛力的生物活性物質,已經成為當前研究的熱點之一。本論文對蘿卜硫素的制備及純化方法等方面的研究進展做一綜述,并對這些方面的研究前景做了展望。

1 蘿卜硫素的制備方法

蘿卜硫素的制備方法有化學合成法、酶法、半合成法等。

1.1 化學合成法

圖1 蘿卜硫素的化學合成路線Fig.1 Synthesis of sulforaphane

一種蘿卜硫素化學合成法是以鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽為原料,與1,4-二溴丁烷反應生成N-烷基鄰苯二甲酰亞胺,通過肼解反應得到烷基胺,再與硫光氣反應生成蘿卜硫素,總收率約為16%[9]。最近Vo等[10]提出了一種新的方法,即以四氫噻吩、甲基碘與NaBF4為原料合成S-甲基四氫噻吩鎓四氟硼酸鹽,后者與NaN3在60 ℃下反應16 h得到1-疊氮-(4-甲基磺酰基)丁烷,再通過施陶丁格反應生成erucin,隨后erucin被H2O2氧化得到蘿卜硫素,整個反應僅需4步,收率達到41%,且產物無需通過色譜法純化(圖1)。Whitesell等人[11]則提出了一種手性合成方法,以手性輔助劑反式-2-苯基環(huán)己醇為原料,經過多步反應得到R-蘿卜硫素?；瘜W合成法反應過程容易控制,易大量生產,但是一般使用有毒試劑為原料,易造成環(huán)境污染,且合成產物是外消旋體,而手性合成方法則步驟多,工藝復雜,收率低。

圖2 蘿卜硫苷的酶促水解途徑Fig.2 Enzymatic hydrolysis of glucoraphanin

1.2 酶法

酶法是以西蘭花、甘藍等蕓薹屬植物為原料提取蘿卜硫苷,再經內源性黑芥子酶水解生成蘿卜硫素。西蘭花、甘藍的苗、花、莖、種子都含有蘿卜硫苷,含量最高的是西蘭花種子或8～10 d的西蘭花苗,因此,蘿卜硫苷或蘿卜硫素的制備一般都以西蘭花種子或苗為原料[12-14]。值得注意的是,蘿卜水解液不含蘿卜硫素,而是Glucoraphenin(1-異硫氰酸酯(4R)-(甲基亞磺?；?-3-丁烯)[15]。

以種子為原料的制備過程一般包括脫脂、酶解、提取三步。由于西蘭花種子含有大量的油脂,因此在酶解之前,首先要用石油醚、正己烷等有機溶劑對種子進行脫脂處理[16]。以苗或蔬菜為原料提取時,則只需酶解、提取兩步。酶解步驟中,蘿卜硫苷經黑芥子酶水解得到蘿卜硫素。考慮到成本、得率等因素,一般采用內源性黑芥子酶[16],但是當內源酶活力較低或失活時,可通過添加外源黑芥子酶提高蘿卜硫素得率[17]。蘿卜硫苷經黑芥子酶水解后,首先生成不穩(wěn)定的中間體(thiohydroxamate-O-sulfonate),然后經洛森型重排(Lossen-type rearrangement)生成蘿卜硫素、蘿卜硫腈以及硫氰酸酯等,其中蘿卜硫素是主要的轉化產物。但在酶解體系pH較低、酶解體系中存在Fe2+或上皮硫特異蛋白(Epithiospecifier protein,ESP)等情況下,蘿卜硫腈的產量會顯著提高(圖2),生成蘿卜硫腈的量與ESP活性呈正比例關系[18-19]。通過抑制ESP活性則可提高蘿卜硫素得率,如Matusheski等[20]發(fā)現降低西蘭花中ESP活性可增加蘿卜硫素得率,即西蘭花在60 ℃條件下加熱5 min后,蘿卜硫素的得率增加,而蘿卜硫腈的得率則降低,這是由于ESP的熱穩(wěn)定性比黑芥子酶要差,受熱易失活,從而可以增加蘿卜硫素的得率,并且減少蘿卜硫腈的產生。

圖3 催化加氫法制備蘿卜硫素的工藝路線Fig.3 Preparation of sulforaphane by catalytic hydrogenation

蘿卜硫苷酶解后,一般用水、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷[21-22]等提取蘿卜硫素。蘿卜硫素易溶于水,但是用水提取時,會把蛋白質、多糖等其它成分也提取出來。蘿卜硫素也易溶于二氯甲烷和乙酸乙酯,考慮到二氯甲烷具有毒性,乙酸乙酯是比較理想的提取溶劑。

由于蘿卜硫苷酶解過程復雜,影響因素很多,因此蘿卜硫素的酶解及提取工藝優(yōu)化也是一個重要的研究內容。在對酶解-提取條件優(yōu)化的報道中,所采用的優(yōu)化手段多是在單因素基礎上采用正交或者響應面實驗考察固液比、水解pH等的交互作用[23-26]。這些研究報道的工藝參數相差都很大,反映了蘿卜硫素的酶解-提取是一個復雜的過程,影響因素非常多。作者課題組分析了各種蕓薹屬植物種子中異硫氰酸酯的種類和含量,其中西蘭花種子中蘿卜硫素含量最高[27];以西蘭花種子為原料,通過單因素實驗,得到蘿卜硫素的提取工藝條件,發(fā)現酶解-提取同步進行時,具有更高的提取效率[22];進一步通過響應面法對蘿卜硫素的酶解、提取工藝進行了優(yōu)化,根據Plackett-Burman設計,從11個變量中篩選出提取得率影響最大的3個因素為提取料液比、水解時間和水解料液比;在此基礎上,用最陡爬坡路徑逼近最大產蘿卜硫素區(qū)域,最后通過中心組合實驗及響應面分析得出優(yōu)化工藝為:水解時間13 min,水解料液比2.9∶1 (mL/g),萃取料液比17.5∶1 (mL/g),在此條件下,蘿卜硫素的得率最高,達14.8 mg/g[28]。

近年來,超聲和微波輔助萃取法在植物活性成分的提取中得到了廣泛的應用。與傳統(tǒng)的溶劑萃取法相比,超聲輔助萃取法溶劑用量較少,萃取時間較短,而微波具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點。Tanongkankit等[29]以甘藍為原料,研究了不同溶劑、微波功率、萃取時間對蘿卜硫素得率的影響,優(yōu)化了提取工藝。他們還比較了溶劑萃取法和微波輔助萃取法對蘿卜硫素得率的影響,表明微波輔助萃取法是一種非常有效的方法,具有得率高、萃取時間短等優(yōu)點,Pongmalai等[30]的研究也表明,微波萃取蘿卜硫素具有更高的能源效率。Briones-Labarca等[31]以智利木瓜(Vasconcellea pubescens)種子為原料萃取蘿卜硫素,對高壓萃取法、超聲波輔助萃取法和傳統(tǒng)萃取法進行了比較,結果表明高壓萃取法具有最高的萃取效率,其次是超聲波輔助萃取法,傳統(tǒng)萃取法的提取率最低。唐斌等[32]的實驗則表明,超聲萃取法提高了提取效率。與其他生物活性物提取過程不同的是,蘿卜硫素的制備包括酶解和提取過程,在使用輔助萃取時,需要注意的是在酶解階段,超聲或微波處理會影響酶的效率,因此輔助萃取僅用于提取階段,而且在超聲或微波輔助萃取時產生的高溫及自由基等對蘿卜硫素的影響也是一個值得注意的問題。

1.3 半合成法

半合成法是以蘿卜硫苷的結構類似物,如glucoraphenin、glucoerucin等為原料,通過生物或化學轉化法得到蘿卜硫苷,再水解得到蘿卜硫素。蘿卜種子中富含的glucoraphenin比蘿卜硫苷多一個雙鍵,因此以glucoraphenin為原料,在高溫高壓下,以氧化鉑、碳鈀等為催化劑進行催化加氫得到蘿卜硫苷,再水解得到蘿卜硫素,工藝路線如圖3所示[33-34]。但是該方法的轉化率較低。

上述催化加氫步驟也可以通過微生物來完成。袁其朋等[35]以glucoraphenin為底物,利用白地霉、白僵霉、黑曲霉等微生物進行還原反應,得到蘿卜硫苷,最高轉化率可達91.9%。

Iori等[36]設計了以glucoerucin為原料制備蘿卜硫素的工藝路線,即以glucoerucin為原料,通過雙氧水氧化得到蘿卜硫苷,再經水解生成蘿卜硫素,如圖4所示。

半合成法的優(yōu)點是原料便宜,蘿卜種子富含glucoraphenin,芝麻菜種子則富含glucoerucin,這些種子都比較廉價易得。因此,如能提高轉化效率,該方法有望具有較好的應用前景。但該方法的缺點是在提取硫代葡萄糖苷前要經過滅酶處理,生成的蘿卜硫苷還需要加入外源硫代葡萄糖苷酶水解得到蘿卜硫素。

圖4 氧化法制備蘿卜硫素的工藝路線Fig.4 Preparation of sulforaphane by oxidation

2 蘿卜硫素的純化

蘿卜硫素純化方法有大孔樹脂吸附法、硅膠柱色譜法、反向高效制備液相色譜法和高速逆流色譜法等。

蘿卜硫素在大孔樹脂上具有良好的吸附性能,因此大孔樹脂吸附法是較理想的蘿卜硫素純化方法。Li[37]和劉錫建[38-39]等都報道了大孔吸附樹脂法純化蘿卜硫素,通過SP850樹脂吸附,乙醇溶液洗脫,可得到純度為85%以上的蘿卜硫素。作者團隊[40]通過吸附平衡實驗、吸附熱力學及吸附動力學方法,研究了水相中SP850大孔吸附樹脂對蘿卜硫素的吸附性能,吸附平衡實驗表明,Langmuir和Freundlic方程都較好地描述了SP850樹脂吸附蘿卜硫素的平衡機制;計算了蘿卜硫素吸附熱力學函數,ΔG<0,ΔS<0,ΔH<0,表明SP850吸附蘿卜硫素是一個放熱過程,隨著溫度升高,ΔG不斷增加,表明在研究溫度范圍內降低溫度有利于蘿卜硫素吸附;吸附動力學實驗表明,吸附過程可以用擬二階模型擬合;顆粒內擴散模型分析表明,SP850吸附蘿卜硫素過程受內擴散控制,蘿卜硫素在SP850上吸附平衡時間小于30 min,液膜擴散是吸附初期的主要速率控制步驟。

表1 蘿卜硫素純化方法的比較

Table 1 Comparison of different purification methods of sulforaphane

方法檢測條件收率純度分離時間參考文獻大孔樹脂吸附HPLCN/A887%85min[38]高效制備液相色譜紫外檢測器(254nm)48/kg99%30min[41]高效制備液相色譜紫外檢測器(254nm)14g/kg95%60min[42]高效制備液相色譜視差折光檢測049g/kgN/A16min[43]硅膠柱色譜紫外檢測器(254nm)25g/kg>90%60min[44]高速逆流色譜紫外檢測器(254nm)37g/kg97%240min[45]

注:N/A:未顯示。

在柱色譜法中,反向高效制備液相色譜法可以得到較高純度的蘿卜硫素。西蘭花種子脫脂、酶解、提取后,可以通過反相制備色譜柱分離純化蘿卜硫素,流動相有乙腈/水[41]、甲醇/水[42]或丙酮/水[43]等。正向硅膠柱色譜法也可以用于純化蘿卜硫素,Liang等[44]以硅膠為固定相,三氯甲烷/甲醇(95∶5)為流動相,可得到90%以上純度的蘿卜硫素,Liang等認為該方法具有操作壓力低,成本相對較低等優(yōu)點。

另外,Liang等[45]還報道了用高速逆流色譜法(HSCCC)分離純化蘿卜硫素,通過正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1∶5∶1∶5,v/v/v/v)的體系,得到純度為97%的蘿卜硫素。作者團隊[46]以西蘭花種子水解液為原料,通過HSCCC法分離純化蘿卜硫素,得出與Liang等相似的結論,得到色譜圖如圖5所示,其中第3個峰是蘿卜硫素,純度為89%。

圖5 西蘭花種子提取物的高速逆流色譜圖Fig.5 HSCCC chromatogram of the crude extract of broccoli seed meal

在上述方法中,大孔樹脂吸附法成本低,處理量大,容易放大,從作者團隊的吸附動力學結果可知,蘿卜硫素在大孔樹脂上的吸附是一個快吸附過程,因而吸附分離的時間較短,但是蘿卜硫素純度稍低。HSCCC法不耗費色譜填料,收率高,樣品無需預處理,但是放大困難。反向高效制備液相色譜法的優(yōu)點是蘿卜硫素的純度較高,但耗費大量溶劑,生產成本較高。因此在蘿卜硫素純度要求不高時,可通過大孔樹脂吸附法制備;純度要求較高時,可先通過大孔樹脂法初步純化,再通過反向高效制備液相色譜法制備。各種純化工藝的方法、檢測條件、收率、純度、分離時間等見表1。

另外一種蘿卜硫素純化方法是先純化蘿卜硫苷,再酶解得到蘿卜硫素。如De Nicola等[47]以150 g羽衣甘藍種子為原料,通過離子交換樹脂和凝膠排阻層析制備得到純度為95%的蘿卜硫苷,再通過兩相體系酶解制備得到1.09 g蘿卜硫素。由于蘿卜硫苷的化學性質穩(wěn)定,因此本方法收率較高,但是在預處理中先需要高溫滅酶,水解過程中需要加入外源黑芥子酶,這是本方法的一個缺點。

3 總結與展望

蘿卜硫素具有抑制癌細胞增殖、誘導細胞周期阻滯和凋亡、抑制腫瘤轉移、抗氧化、免疫調節(jié)、抗炎等多種作用,引起了國內和國外學者對蘿卜硫素的廣泛關注。蘿卜硫素的制備、純化工藝已經有較多的文獻報道,但仍然有許多方面值得我們進一步深入研究:

深入研究ESP活性的抑制條件。如前所述,抑制ESP活性可以顯著提高蘿卜硫素的得率。盡管已有文獻通過加熱法抑制了ESP活性,然而加熱也會使黑芥子酶失去活性。課題組已有的實驗數據顯示,不同品種西蘭花中ESP的活性和熱穩(wěn)定性也有一定的差異,因此有必要對這兩種酶的活性、結構和穩(wěn)定性之間的構效關系以及抑制條件等進行深入的研究。

廉價蘿卜硫素制備和純化工藝研究。蘿卜硫素的提取通常都用乙酸乙酯、二氯甲烷等為溶劑,然而蘿卜硫素也易溶于水或乙醇,因此今后的研究可以考慮以水、乙醇等為溶劑萃取蘿卜硫素,從而減少生產成本及廢物的排放,并通過大孔樹脂吸附等方法除去多糖和蛋白質等成分。

新興純化工藝的應用。例如分子蒸餾法作為一種不斷發(fā)展的特殊蒸餾分離技術已得到廣泛應用,該技術特別適用于高沸點、熱敏性及易氧化物質的分離。蘿卜硫素在分離純化中易氧化降解,且其沸點較高,若將此技術應用到蘿卜硫素的分離純化中,不僅可提高產品收率,在一定程度上還可保障產品的質量。

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Preparation and purification of sulforaphane-an overview

WU Yuan-feng1,2,3,XU Wei-liang1,2,3,SHEN Yu-ke1,2,3,XIAO Gong-nian1,2,3, MAO Jian-wei1,2,3,*,HUANG Jun1,2,3,YOU Yu-ru1,2,3

(1.School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry,Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023,China; 2.Zhejiang Provincial Key Lab for Chem & Bio Processing Technology of Farm Produces,Hangzhou 310023,China; 3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing,Hangzhou 310023,China)

Inthisreview,differentproductionandpurificationmethodsengagedinsulforaphaneresearchweresummarizedandcompared.Thepreparationmethodsforsulforaphaneincludechemicalsynthetic,semisyntheticandenzymaticmethods,andpurificationmethodsincludemacroporousresinadsorption,silicagelcolumnchromatography,preparativeHPLCchromatographyandhighspeedcountercurrentchromatography.Thentheprospectofsulforaphanepreparationandpurificationwerealsodiscussed.

Sulforaphane;preparation;purification;researchprogress

2016-03-21

吳元鋒(1976-)，男，博士，副教授，研究方向：天然活性物研究與開發(fā)，E-mail:wyfhz@126.com。

*通訊作者:毛建衛(wèi)(1964-)，男，碩士，教授，研究方向：農產品加工，E-mail:zjhzmjw@163.com。

浙江省自然科學基金(LY16C200005)；杭州市科技計劃項目(20140432B108)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)19-0381-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.066