不同方法提取費(fèi)約果葉片香氣成分的比較研究

白俊英,黃仁華,陸云梅,余 游,王 丹

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

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不同方法提取費(fèi)約果葉片香氣成分的比較研究

白俊英,黃仁華*,陸云梅,余 游,王 丹

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

分別采用索氏抽提法、超聲波輔助溶劑萃取法和頂空固相微萃取法對(duì)費(fèi)約果葉片中所含香氣成分進(jìn)行提取,經(jīng)GC-MS進(jìn)行分析,結(jié)合譜庫(kù)檢索技術(shù),采用峰面積歸一化法進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明,索氏抽提法所得香氣物質(zhì)中鑒定出揮發(fā)性成分20種,占總揮發(fā)性成分的70.357%,且以烷烴為主,超聲波輔助溶劑萃取法所得香氣物質(zhì)中鑒定出揮發(fā)性成分17種,占總揮發(fā)性成分的65.222%,且以酯類為主,頂空固相微萃取法所得香氣物質(zhì)中鑒定出揮發(fā)性成分最多,有42種,占總揮發(fā)性成分的76.899%,且以萜烯類為主。由此可見,在費(fèi)約果葉片香氣成分分析中頂空固相微萃取法能得到最多的香氣組分,索氏抽提法次之,超聲波輔助溶劑萃取法得到的香氣物質(zhì)最少。

索氏抽提,超聲波輔助溶劑萃取,頂空固相微萃取,香氣成分

目前,關(guān)于天然植物香氣成分提取方面的報(bào)道有很多,提取的方法也多種多樣,陳常頌等[1]利用同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)提取茶葉香精油;謝吉林等[2]利用減壓蒸餾法(VDE)提取普洱茶香氣物質(zhì);劉煜宇等[3]利用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)(SFE)提取煙草花香氣成分;王延平等[4]采用固相微萃取(SPME)提取大紅袍茶提取物的揮發(fā)性致香成分。頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)是上世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的新的樣品預(yù)處理技術(shù),特別適用于微量樣品的分析。頂空固相微萃取技術(shù)在固相微萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上直接采用萃取頭頂空吸附進(jìn)樣,具有操作簡(jiǎn)便快捷、無(wú)試劑污染等重要特點(diǎn)[5]。香氣物質(zhì)的檢測(cè)通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析技術(shù),能得到較好的定性、定量結(jié)果[6]。

費(fèi)約果是一種集食用、藥用、園藝觀賞于一體的新興果樹,原產(chǎn)于阿根廷北部,烏拉圭、巴拉圭山區(qū)一帶,目前在世界多個(gè)國(guó)家有種植且在新西蘭生產(chǎn)、發(fā)展最好[7-8]。費(fèi)約果果實(shí)、花、葉皆散發(fā)出濃郁香味,且含多種多酚類有效成分,具有一定的食用藥用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[9-12]。相應(yīng)產(chǎn)品在國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上皆供不應(yīng)求。費(fèi)約果葉片四季常綠,耐修剪,成熟葉片呈濃綠色革質(zhì),厚實(shí)且有光澤,修剪后散發(fā)令人愉快的芬芳?xì)馕?可作為食品、化妝品添加劑的重要來源。在美洲、新西蘭等地,費(fèi)約果為常見庭院植物,枝葉修剪每年產(chǎn)生大量垃圾,葉片資源往往被浪費(fèi)掉;而中國(guó)的費(fèi)約果引種栽培已有十余年時(shí)間,在廣大科研工作者的努力下,未來必將走進(jìn)千家萬(wàn)戶。可以預(yù)見,對(duì)費(fèi)約果的深入研究必將促進(jìn)新興果樹費(fèi)約果在國(guó)內(nèi)外的發(fā)展。據(jù)此,本研究對(duì)費(fèi)約果葉片香氣成分進(jìn)行了提取,并比較了頂空固相微萃取法與傳統(tǒng)的索氏抽提法和溶劑萃取法在費(fèi)約果香氣分析方面的異同,以求為費(fèi)約果葉片香氣成分的開發(fā)利用及后期相關(guān)研究提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費(fèi)約果 四川綿陽(yáng),品種為“庫(kù)利激”兩年生潔凈葉片,于2015年5月7日上午9時(shí)采摘于西南科技大學(xué)西山校區(qū)費(fèi)約果種植園;乙醚、無(wú)水氯化鈣 分析純;丙酮 色譜純;水 超純水。

Varian 3900-Saturn 2100氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、氣相色譜-質(zhì)譜口進(jìn)樣針 美國(guó)Agilent公司;固相微萃取萃取手柄和Carboxen?/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS,75 μm)萃取頭 美國(guó)Supelco公司;20 mL頂空瓶 四川生科力科技有限公司;HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;SZF-06A型脂肪測(cè)定儀 上海華睿儀器有限公司;電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;PH-030(A)型干燥/培養(yǎng)二用箱箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 索氏抽提法 取新鮮費(fèi)約果葉片若干,冷凍干燥后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎,準(zhǔn)確稱取費(fèi)約果葉片粉末4 g于濾紙筒中,包扎好后置于索氏抽提器的抽提筒內(nèi),組裝好索氏抽提裝置后,用100 mL乙醚索氏提取至回流溶劑無(wú)色。重復(fù)3組,合并提取液?；厥找颐阎良s150 mL。加入無(wú)水氯化鈣顆粒8 g,脫水過夜。過濾后收集濾液,冷藏密封保存,備用。GC-MS進(jìn)樣分析時(shí)取5 mL樣液稀釋3倍,取1 μL進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.2 超聲波輔助溶劑萃取法 取新鮮費(fèi)約果葉片若干,冷凍干燥后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎,準(zhǔn)確稱取費(fèi)約果葉片粉末10 g于錐形瓶中,加入100 mL乙醚,密封,超聲30 min后,取上清液于另一錐形瓶中,殘?jiān)性偌尤?00 mL乙醚,重復(fù)提取3次,合并三次浸提液(墨綠色帶暗紅狀)。將浸提液旋轉(zhuǎn)濃縮至約150 mL。加入無(wú)水氯化鈣顆粒8 g,脫水過夜。過濾后收集濾液,冷藏密封保存,備用。GC-MS進(jìn)樣分析時(shí)取5 mL樣液稀釋3倍,取1 μL進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.3 頂空固相微萃取法 取新鮮費(fèi)約果葉片若干,冷凍干燥后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎,準(zhǔn)確稱取費(fèi)約果葉片粉末1.5 g置于20 mL頂空瓶中,用具有聚四氟乙烯墊密封蓋密封,將瓶放在60 ℃水浴鍋中水浴平衡30 min后,將老化(首次使用時(shí),萃取頭需要在氣相色譜進(jìn)樣口老化,溫度300 ℃,時(shí)間30 min;以后每次使用前需在250 ℃下處理30 min,以確保脫去其可能吸附的揮發(fā)性成分)后的75 μm CAR/PDMS萃取頭迅速插入樣品瓶頂空部分,距離樣品一定高度,于60 ℃加熱吸附40 min,吸附后的萃取頭取出,并迅速插入氣相色譜進(jìn)樣口,于250 ℃解析6 min,用于GC-MS分析,同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3 GC-MS測(cè)定條件

1.3.1 色譜條件 實(shí)驗(yàn)采用Varian 3900-Saturn 2100 GC-MS,色譜柱為HP-5MS,含5%苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),色譜進(jìn)樣口溫度:250 ℃,進(jìn)樣量1 μL,柱室溫度:40 ℃,保持1 min,采用程序升溫以5 ℃/min的升溫速率升至240 ℃,保持15 min,載氣:高純氦氣,流速1 mL/min,不分流進(jìn)樣,柱流量1 μL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜接口溫度:220 ℃,電離方式:EI,電子能量:70 eV,離子源溫度:190 ℃;四級(jí)桿溫度:210 ℃,調(diào)諧方式:標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧,質(zhì)量掃描方式:SCAN,溶劑延長(zhǎng):3 min,掃描模式:全掃描參數(shù),質(zhì)量掃描范圍:40～300 amu。

1.3.3 GC-MS測(cè)定方法 方法參考呂世懂等[13]并結(jié)合儀器操作規(guī)程和具體實(shí)際。先用丙酮洗滌GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)樣針6次以上,然后用待測(cè)樣液潤(rùn)洗6次以上,排除其它物質(zhì)干擾。待GC柱室溫度升至設(shè)定溫度后,開始進(jìn)樣。用進(jìn)樣針吸取1 μL樣液,迅速注入進(jìn)樣口中,縮出進(jìn)樣針。開始測(cè)試。樣品經(jīng)GC-MS分析,各分離組分利用譜圖庫(kù)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采用峰面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量分析,求得各揮發(fā)性成分相對(duì)含量及離子峰出峰個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 費(fèi)約果葉片香氣成分GC-MS分析結(jié)果

圖1為不同方法提取費(fèi)約果葉片揮發(fā)性成分所得化合物的GC-MS總離子流色譜圖。由圖可知,不同方法所得離子流色譜圖中,各色譜峰保留時(shí)間和峰強(qiáng)度有所差異。索氏抽提法能夠得到20種化合物,超聲波輔助溶劑萃取法能夠得到17種化合物,頂空固相微萃取法能夠得到42種化合物。

圖1 不同方法提取費(fèi)約果葉片香氣成分總離子流圖Fig.1 Total ionic chromatograms of aroma components in feijoa leaves by different methods注：a-索氏抽提法,b-超聲波輔助溶劑萃取法,c-頂空固相微萃取法。

各成分的色譜峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖,經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),鑒定出香氣成分,以峰面積歸一化法確定各組分的相對(duì)含量。結(jié)果如表1所示。

2.2 不同提取方法提取費(fèi)約果葉片所得香氣成分分析

索氏抽提法提取的香精油經(jīng)GC-MS分析后,檢測(cè)到36個(gè)峰,在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)共鑒定出20個(gè)香氣組分。含量最高的是烴類,其次是醇類,隨后是酯類、萜烯類、其它類和醛酮類,分別占香氣總量的34.669%、18.989%、7.429%、6.957%、1.765%、0.548%。由此可見,索氏抽提法為含烷烴成分和醇類成分較多的樣品的分析提供了參考。其中,2,3-丁二醇可用于制備油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸藥及藥物手性載體等,在我國(guó)往往被添加到白酒中,以改善風(fēng)味。

表1 三種方法提取費(fèi)約果葉片揮發(fā)性成分分析

Table 1 GC-MS analysis results of aroma components in feijoa leaves by different extraction methods

序號(hào)化合物名稱分子式相對(duì)分子量相對(duì)含量(%)索氏抽提超聲波輔助溶劑萃取頂空固相微萃取醇類12，3-丁二醇C4H10O2907974--2(2R，3R)-(-)-2，3-丁二醇C4H10O290-0481-3(R)-(-)-2-戊醇C5H12O88-0155-43-甲基-2-丁醇C5H12O8805630573-52-異丙氧基乙醇C5H12O210410106--61-己炔-3-醇C6H10O98--01387反-2-甲基環(huán)戊醇C6H12O100--07958葉醇C6H12O100--41909(E)-2-己烯-1-醇C6H12O100--0157

續(xù)表

續(xù)表

注:表中“-”表示未檢測(cè)到。超聲波輔助溶劑萃取法提取的香精油經(jīng)GC-MS分析后,檢測(cè)到26個(gè)峰,在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)共鑒定出17個(gè)香氣組分。其中,含量最高的是酯類,其次是萜烯類,隨后是烴類、其它類、醛酮類和醇類,分別占香氣總量的32.591%,20.652%,6.742%、1.855%、1.742%、1.640%。由此可見,超聲波輔助溶劑萃取法為含酯類成分和萜烯類成分較多的樣品的分析提供了參考。萃取出的組分中己酸丁酯呈清香、蠟香,有菠蘿和葡萄酒似香氣。

頂空固相微萃取法提取的香精油經(jīng)GC-MS分析后,檢測(cè)到63個(gè)峰,在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)共鑒定出42個(gè)香氣組分。其中,含量最高的是萜烯類,有20種,其次是醇類,有10種,隨后是醛酮類、酯類、烴類、其它類和醚類,分別占香氣總量的45.627%,14.860%,10.752%、3.481%、1.656%、0.420%、0.103%。由此可見,頂空固相微萃取法為含萜烯類成分和醇類成分較多的樣品的分析提供了參考。提取出的組分中1-石竹烯是國(guó)標(biāo)允許使用的食品香料,具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香和溫和的丁香香氣;α-蓽澄茄油萜具有花似的、檸檬的香氣;水芹烯具有令人愉快的、新鮮的、柑橘的、胡椒的氣味。

2.3 不同方法提取費(fèi)約果葉片香氣成分的比較

由表1可知,三種方法共鑒定出費(fèi)約果葉片中66種香氣成分。其中,2,3-丁二醇、2-異丙氧基乙醇、3-羥基-2-丁酮、2-乙基-2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烷、2-甲氧基甲基-2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烷、1,3,5-環(huán)庚三烯、(S)-(-)-乳酸異丙酯、乙酸-3-辛醇酯、萘只在索氏抽提法所得的香氣組分中出現(xiàn)；(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、(R)-(-)-2-戊醇、5-甲基-4-正辛醇、L-(-)-甘油醛、γ-古蕓烯、己酸丁酯、十五烷酸-14-甲酯只在超聲波輔助溶劑萃取法中出現(xiàn),且己酸丁酯含量最高；頂空固相微萃取法所得香氣組分中鑒別出的物質(zhì)最多,且有36種組分只在頂空固相微萃取法中出現(xiàn),其中,多為萜烯類。

索氏抽提法和超聲波輔助溶劑萃取法所得香氣組分中共有物質(zhì)較多,包括:3-甲基-2-丁醇、2-十六烷醇、2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烷、1,1-二乙氧基乙烷、[2.4]七螺-4,6-二烯烴、香橙烯、乙基苯、2,6-二叔丁?；?對(duì)苯二酚(氫醌),8種,其中2,4,5-三甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烷和[2.4]七螺-4,6-二烯烴在兩種方法中含量均較高。索氏抽提法和頂空固相微萃取法中共有物為γ-欖香烯、大根香葉烯D、蓽澄茄油萜。超聲波輔助溶劑萃取法和頂空固相微萃取法中共有物質(zhì)為l-去氫白菖烯、1-石竹烯。

3 討論

索氏抽提法可以避免溶劑的揮發(fā)損失且溶劑可回收,但在一定溫度下長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行反應(yīng),可能造成有效成分的破壞,因而只能反映費(fèi)約果葉片部分香氣特性;超聲波輔助溶劑萃取法萃取時(shí)間短,溫度低,萃取徹底,但超聲波產(chǎn)生的空化作用可能造成某些香氣成分產(chǎn)生化學(xué)變化[14];頂空固相微萃取法直接在頂空部分萃取樣品,簡(jiǎn)便快捷,目標(biāo)物損失少,所以能得到相對(duì)最多的香氣組分,但頂空固相微萃取加熱溫度低,萃取物多為揮發(fā)性成分,可能遺漏高沸點(diǎn)物質(zhì)和半揮發(fā)性物質(zhì)。索氏抽提法和超聲波輔助溶劑萃取法的提取原理都是溶劑萃取,溶劑相同,所以得到較多共同組分。頂空固相微萃取法的萃取原理是一定溫度下?lián)]發(fā)性成分在萃取纖維上的富集與解析,與溶劑萃取差異較大,所得香氣組分差異也大。在鑒定出的物質(zhì)中,沒有一種香氣物質(zhì)在三種方法中同時(shí)出現(xiàn),可能是因?yàn)槿N方法的共有物質(zhì)未能被鑒定,也可能是因?yàn)轫斂展滔辔⑤腿》ㄡ槍?duì)的是低沸點(diǎn)物質(zhì)和揮發(fā)性強(qiáng)的物質(zhì),而索氏抽提法和超聲波輔助溶劑萃取法得到的物質(zhì)沸點(diǎn)較高且在乙醚中溶解性強(qiáng)。具體原因有待進(jìn)一步研究。

三種方法提取費(fèi)約果葉片所得香氣成分主要為醇類、萜烯類、醛酮類、酯類、烴類、醚類和其它,各種物質(zhì)特有的香味相長(zhǎng)相消、相互配合,最終構(gòu)成了費(fèi)約果葉片復(fù)雜而獨(dú)特的香氣。費(fèi)約果葉片悅?cè)说南銡獠粌H與葉片中香氣組分的含量有關(guān),還與各組分的氣味閾值相關(guān)聯(lián)[15]。各類物質(zhì)香氣組分的閾值及其對(duì)費(fèi)約果葉片香氣的貢獻(xiàn)還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

索氏抽提法提取的物質(zhì)經(jīng)GC-MS分析后,檢測(cè)到36個(gè)峰,在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)共鑒定出20種香氣成分。超聲波輔助溶劑萃取法提取的物質(zhì)經(jīng)GC-MS分析后,檢測(cè)到26個(gè)峰,鑒定出17種香氣成分。頂空固相微萃取法提取的物質(zhì)經(jīng)GC-MS分析后,檢測(cè)到63個(gè)峰,鑒定出42個(gè)香氣組分。就得到的香氣成分種類而言,頂空固相微萃取法效果最好,索氏抽提法次之,超聲波輔助溶劑萃取法得到最少的香氣組分。三種方法鑒別出的總香氣組分有66種,每種提取方法所得香氣組分種類及含量各有不同,說明三種提取方法各有特色,能很好實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。在實(shí)際分析中,同時(shí)采用幾種不同提取方法所得物質(zhì)更能全方位反映樣品組成及性質(zhì)。在不同要求的研究和應(yīng)用中,可根據(jù)不同方法提取費(fèi)約果葉片香氣成分中不同組分的呈香特點(diǎn)及含量將其應(yīng)用到需求中,如稀有香味物質(zhì)制成高檔香料或據(jù)其特點(diǎn)進(jìn)行人工合成,量大且常見的香氣物質(zhì)可作為普通香味添加劑天然來源。

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Comparison of aromatic components infeijoasellowianawith different extraction methods

BAI Jun-ying,HUANG Ren-hua*,LU Yun-mei,YU You,WANG Dan

(Southwest University of Science and Technology,College of Life Science and Engineering,Mianyang 621010,China)

ThearomaticcomponentsinfruitofFeijoa sellowianawereextractedbysoxhletextraction,ultrasonicassistedsolventextraction,andheadspacesolidphasemicro-extraction,analyzedbygaschromatography-massspectrometry,combinedwiththespectrallibraryretrievaltechnology,anddeterminedbypeakareanormalizationmethod.Theresultsshowedthattherewere20compoundsidentifiedbysoxhletextractionandthepercentoftotalpeakareawas70.357%andthemajorcompoundwasalkane,therewere17compoundsidentifiedbyultrasonicassistedsolventextractionandthepercentoftotalpeakareawas65.222%andthemajorcompoundswasester,andtherewere42compoundsbyheadspacesolidphasemicro-extraction,76.899%oftotalpeakareaandthemajorcompoundswasterpenoid.Thisshowedthatthemostkindofaromacompositionscanbeobtainedbyheadspacesolidphasemicro-extraction,followedbysoxhletextraction,andtheleastaromacompositionscanbeobtainedbyultrasonicassistedsolventextraction.

soxhletextraction;ultrasonicassistedsolventextraction;headspacesolidphasemicro-extraction;aromaticcomponents

2016-03-14

白俊英(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分，E-mail：337327450@qq.com。

*通訊作者:黃仁華(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：植物有效成分功能研究及開發(fā)利用， E-mail：huangrenhua@swust.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31000259);四川省科技廳“十一五”科技項(xiàng)目(14zs2105)；校實(shí)驗(yàn)室開放基金(15xnkf03)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)19-0302-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.050